Calcitoninum salmonis

2001

Lososí kalcitonin

Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu10

Leu-His-Lys-Leu-Gin-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gty-Ser20

Thr-Pra-NHZ

Je to syntetický polypeptid, jehož struktura odpovídá lososímu kalcitoninu I. Snižuje koncentraci vápníku v plazmě savců tím, že snižuje vyplavování vápníku z kostí. Získává se chemickou syntézou a je dostupný jako acetat. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, obsahuje 90,0 % až 105,0 % peptidu C1a5H₂aoNaa0a8S2. Dohodou bylo stanoveno, že pro účely označování přípravků obsahujících lososi kalcitonin, 1 miligram lososího kalcitoninu (C145H240N₄₄O₄₈S2) odpovídá 6 000 m.j. biologické účinnosti.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek. Je snadno rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. Provede se tenkovrstvá chromatogra%e (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografii RI.

   Zkoušený roztok. 4 mg se rozpustí ve 2 ml směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98). Připraví se bezprostředně před použitím.

   Porovnávací roztok. Obsah lahvičky 10sosího kalcitoninu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny octové R a vody R (2 + 98) tak, aby se získala koncentrace 2,0 mg/ml. Připravá se bezprostředně před použitím.

   Na vrstvu se nanese po 1 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (6 + 20 + 24 + 30) po dráze 15 cm. Vrstva se 1 h suší na vzduchu, potom se 10 min zahřívá při 110 °C a ještě horká vrstva se postříká čerstvě připraveným chlornanem sodným RS zředěným před použitím vodou R na koncentraci obsahující v litru 5 g aktivního chloru. Vrstva se suší v proudu studeného vzduchu tak dlouho, až na postříkané části vrstvy pod startem po nanesení kapky škrobu s jodidem draselným RS vzniká nejvýše velmi slabě modré zbarvení; další sušení v proudu vzduchu se zastaví. Potom se vrstva postříká škrobem s jodidem draselným RS do zřetelného objevení skvrn. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

2. Hodnotí se chromatogramy získané ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Kyselina octová (2.5.34). 4,0 % až 15,0 %.

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (5 + 95) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Aminokyseliny. Stanoví se pomocí analyzátoru aminokyselin. Přístroj se kalibruje pomocí směsi obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a následujících aminokyselin:

společně s polovinou ekvimolárního množství L-cystinu. K validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. norleucin R.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se smíchá v pečlivě vymyté silnostěnné zkumavce délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50 % (VN). Zkumavka se ponoří do chladicí směsi při -5 °C a evakuuje na tlak nižší než 133 Pa. Potom se těsně uzavře a zahřívá 16 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se zkumavka otevře a její obsah se přenese do 10ml baňky za použití pětkrát 0,2 ml vody R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R; zbytek se převede do vody R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R; postup se opakuje ještě jednou. Zbytek se převede do tlumivého roztoku vhodného pro analyzátor aminokyselin a zředí se na vhodný objem stejným tlumivým roztokem. Přesně změřený vhodný objem zkoušeného roztoku se vpraví do analyzátoru aminokyselin.

Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní podM jednotlivých aminokyselin se vypočte za předpokladu, že dvacetina molárního množství kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, prohnu, glycinu, valinu, leucinu, histidinu, argininu a lysinu se rovná jedné. Relativní obsah jednotlivých aminokyselin je v rozmezí: kyselina asparagová 1,8 až 2,2; kyselina glutamová 2,7 až 3,3; prolin 1,7 až 2,3; glycin 2,7 až 3,3; valin 0,9 až l, l;leucin 4,5 až 5, 3; histidin 0,9 až 1,1; arginin 0,9 až 1,1; lysin 1,8 až 2,2; serin 3,2 až 4,2; threonin 4,2 až 5,2; tyrosin 0,7 až 1,1; polovina množství cystinu 1,4 až 2,1.

Příbuzné peptidy. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) způsobem popsaným v odstavci Stanovení obsahu. Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na získaném chromatogramu plocha žádného píku, kromě hlavního píku, není větší než 3,0 % celkové plochy píků. Součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píku rozpouštědla a k píkům s plochou menší než 0,1 % plochy hlavního píku.

Voda, mikrostanovení (2.5.32). Nejvýše 10,0 %.

Kyselina octová a voda. Nejvýše 20 %. Vypočítá se z hodnot získaných ve zkouškách Kyselina octová a Voda.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňující bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 1000 m.j. endotoxinu v miligramu 10sosího kalcitoninu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zkoušená látka se rozpustí v mobilní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.

Porovnávací roztok. Obsah lahvičky lososího kalcitoninu CRL se rozpustí v mobilní fázi A tak, aby se získala koncentrace 1,0 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Obsah lahvičky N-acetyl-cys1kalcitoninu CRL se rozpustí ve 400 µl mobilní fáze A a přidá se 100 µl zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min:
  • mobilní fáze A: 3,26 g tetramethylamouiumhydroxidu R se rozpustí v 900 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a smíchá se se 100 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,
  • mobilní fáze B: 1,45 g tetramethylamoniumhydroxidu R se rozpustí ve 400 ml vody R, pH se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 2,5 a promíchá se s 600 ml acetonitrilu pro chromatografii R, zfiltruje se a odplyní,

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
  0 - 30	72 → 48	28 → 52	lineární gradient
  30 - 32	48 → 72	52 → 28	návrat k počátečním podmínkám
  32 - 55	72	28	ustalování

• spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje na 65 °C. Kolona se ustaluje směsí objemových dílů mobilní fáze A a mobilní fáze B (28 + 72).

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Pokud je chromatogram zaznamenán za předepsaných podmínek, relativní retenční čas píku N-acetyl-cys'kalcitoninu vztažený k hlavnímu píku je asi 1,15. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky odpovídajícími kalcitoninu a N-acetyl-cyslkalcitoninu je nejméně 5,0 a faktor symetrie pro pík N-acetylcyslkalcitoninu není větší než 2,5. Je-li třeba, upraví se počáteční poměr mobilní fáze A : B.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku a 20 µl porovnávacího roztoku.

Obsah lososího kalcitoninu se vypočítá z plochy píků na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu (C145H240N₄₄O₄₈S2) v lososím kalcitoninu CRL. Provede se tangenciální integrace ploch piků.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Pokud je látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah peptidu kalcitoninu (C145H240N₄₄O₄₈S2),
• kde je to vhodné, zda je látka sterilní,
• kde je to vhodné, zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.