Corticotropinum

Kortikotropin

Je to látka, která se získává z předního laloku hypofýzy prasete. Obsahuje kortikotropní peptid, který zvyšuje sekreci kortikoidů v nadledvinách. Získaný materiál se zbaví nečistot a vysuší se vhodným způsobem. Účinnost je nejméně 70 m.j. v miligramu.

Výroba

Připravuje se v prostředí, které minimalizuje stupeň mikrobiálního znečištění.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý hygroskopický prášek nebo vločky. Jeho roztok (10 g/l) je čirý nebo slabě opalizující.

Zkoušky totožnosti

1. Snižuje koncentraci kyseliny askorbové v nadledvinách po podání ve zkoušce Stanovení účinnosti (zkouška A nebo zkouška B).
2. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1,0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,05 mol/l RS. Porovnávací roztok. 1 mg kortikotropinu CPcL se rozpustí v 1, 0 ml kyseliny chlorovodíkové 0,05 mol/l RS.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   • nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 m),
   • Mobilních fází s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
     • mobilní fáze A - roztok dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na 2,0,
     • mobilní fáze B - acetonitril R,
   • spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

   Kolona se uvede do rovnovážného stavu směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (20 + 80) a 5 min se zaznamenává chromatogram. Dále se provede gradientová eluce s lineárně rostoucím podílem mobilní fáze B na 40 objemových dílů o 0,33 % (V/V) za minutu po dobu 60 min. Nakonec se 15 min eluuje směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (20 + 80). Nastříkne se odděleně 100 1 každého roztoku. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže asymetrie hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku je 0,8 až 2,0 a jestliže počet teoretických pater vypočtených pro hlavní pík je nejméně 1000.

3. Vyhodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku se poloha hlavní zóny shoduje s polohou hlavní zóny na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 5, 0; měří se roztok (10 g/l) ve vodě prosté oxidu uhličitého R. Nečistoty vyšší molekulové hmotnosti než kortikotropin. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1 ml roztoku kyseliny octové R (60 g/l) obsahující dodecylsíran sodný R (10 g/l). Zahřívá se 10 min na 100 °C a nechá se zchladnout.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,85 m a vnitřního průměru 10 mm naplněné polyakrylamidem nebo dextranem síťovaným pro chromatografii s dělicí schopností pro peptidy o relativní molekulové hmotnosti přibližně 1000 až 10 000,
• mobilní fáze: roztok kyseliny octové R (60 g/l) o průtoku 7 mUh,
• spektrofotometrického detektoru, 276 nm, se zapisovačem a s průtokovou kyvetou o objemu nejvýše 1 ml. Detektor a zapisovač se nastaví tak, aby rozsah stupnice zapisovače odpovídal o, 5 jednotky absorbance.

Kolona se uvede do rovnovážného stavu roztokem kyseliny octové R (60 gn), nastříkne se 0,4 ml zkoušeného roztoku na 1 cmZ plochy průřezu kolony a provede se eluce. Součet ploch všech píků eluovaných před hlavním pikem není větší než 5,0 % součtu ploch všech píků na chromatogramu.

Příbuzné bílkoviny. Provede se elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (2.2.31). Použije se sloupec gelu délky 80 mm a průměru 5 mm a tlumivý roztok trometamol-glycinový o pH 8,3. Elektroda v dolní zásobní nádobce tvori anodu a v horní nádobce katodu.

Příprava gelu. Smíchají se 3 díly vody R, 3 díly roztoku obsahujícího ve 100 m128 g akrylamidu R a 0,735 g methylenbisakrylamidu R a 1 díl roztoku obsahujícího ve 100 m136,6 g trometamolu R, 0,23 ml tetramethylethylendiaminu R a 48,0 ml kyseliny chlorovodíkové R. Roztok se odplyní a přidá se 1 díl roztoku peroxodisíranu diamonného R (5,6 g/l).

Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 1 ml tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a zředí se roztokem sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Porovnávací roztok (a). 1 mg kortikotropinu CRL se rozpustí v 1 ml tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a zředí se roztokem sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Porovnávací roztok (b).1 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a roztoku sacharosy R (400 g/l) na 2 ml. Porovnávací roztok (c). 1 ml porovnávacího roztoku (b) se zředí směsí stejných objemových dílů tlumivého roztoku trometamol-glycinového o pH 8,3 a roztoku sacharosy R (400 g/l) na 2 ml.

Na povrch gelu se odděleně nanese po 100 µl každého roztoku. Po přidání tlumivého roztoku se přidá 0,2 ml modři bromfenolové RS. Elektroforetický proces probíhá 30 min při konstantním proudu 1 mA na trubičku, dále 100 min při proudu 3 mA na trubičku. Gely se 1 h barví v roztoku černi amido 10 B R (10 g/l) v 7% roztoku (V/V) kyseliny octové R. Poté se gely 24 h vymývají v 7% (V/V) roztoku kyseliny octové R Elektroforeogramy se vyhodnotí pomocí lampy se studeným světelným zdrojem. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku není žádná zóna intenzívnější než zóna se stejnou pohyblivostí, j ako má hlavní zóna na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) . Zkoušku lze hodnotit, jestliže elektroforeogram porovnávacího roztoku (c) vykazuje viditelnou zónu; na elektroforeogramech porovnávacích roztoků (a), (b) a (c) je patrna gradace intenzity zbarvení.

Presorický účinek. Nejvýše 5 m.j. presorického účinku na 100 m.j. kortikotropní účinnosti. Účinek zkoušené látky na krevní tlak potkana se porovnává s účinkem mezinárodního standardu lysin-vasopresinu nebo referenčního přípravku lysin-vasopresinu kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Ke zkoušce se použije bílý laboratorní potkan, samec o hmotnosti přibližně 300 g. Do ocasní žíly zvířete se vstříkne pomalu roztok vhodného alfa-adrenergního blokátoru v dávce např. 10 ml/kg tělesné hmotnosti. Roztok se připraví rozpuštěním 5 mg fenoxybenzamoniumchloridu R v 0,1 ml lihu 96% R. Přidá se 0,05 ml kyseliny chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se roztokem chloridu sodného R (9 g/l) na 5 ml. Za 18 h se potkan anestezuje vhodným anestetikem tak, aby nenastalo nepříznivé ovlivnění krevního tlaku. Za 45 min až 60 min se upevní potkan připoutáním zadních končetin v poloze na zádech k operačnímu stolku. Zavede se skleněná nebo polyethylenová kanyla o zevním průměru 2,5 mm do průdušnice a vypreparuje se arteria carotis, aby byla připravena pro zavedení kanyly. V místech tříselného vazu se vypreparuje femorální žíla. K jedné straně se odkloní povrchová stydká žíla a nastříhne se femorální žíla směrem k tříselnému vazu. Z hloubky přicházející přívodní větev femorální žíly se podváže, aby se zabránilo krvácení při zavádění kanyly. Do femorální žíly se zavede krátká polyethylenová kanyla o zevním průměru 1 mm, připevní se dvěma podvazy a připojí se pomocí krátké ohebné hadičky na byretu s obsahem 1 ml s připojenou skleněnou nálevkou s ostrým zakončením. Byreta je naplněna roztokem chloridu sodného R (9 g/l) o teplotě asi 37 °C. Preparované místo a kanyla se zakryjí navlhčenou chirurgickou rouškou, která se připevní. Vstříkne se heparin rozpuštěný v roztoku chloridu sodného R (9 g/l) v dávce 200 m.j./100 g hmotnosti pokusného zvířete. Do arteria carotis se zavede kanyla o zevním průměru 1 mm a naplní se pomocí hadiček roztokem chloridu sodného R (9 g/l) s heparinem a napojí se na vhodný přístroj, který zaznamenává krevní tlak. Centrální a periferní nervový systém, včetně obou vagů a souvisejících sympatických nervů, zůstávají bez porušení. Umělé dýchání není zapotřebí. Všechny roztoky se vstříknou do žitní kanyly pomocí lml injekční stříkačky dělené po 0,01 ml. Po každém podání se vstříkne 0,2 ml roztoku chloridu sodného R (9 g/l) z byrety. Dává se pozor, aby nebyl vstříknut vzduch.

Referenční přípravek a zkoušená látka se naředí roztokem chloridu sodného R (9 g/l) tak, aby vstřikovaný objem byl v rozmezí 0,1 ml až 0,5 ml. Zvolí se dvě dávky porovnávacího roztoku tak, aby vzestup krevního tlaku odpovídal o kPa pro nižší dávku a 6,67 kPa pro vyšší, ale ne maximální dávku. Poměr nižší k vyšší dávce je určen vzestupem krevního tlaku a je obvykle 3 : 5. Pro počáteční přiblížení se mohou zkusit dávky 3 milijednotky a 5 milijednotek. U referenčního lysin-vasopresinu se provede výpočet geometrického průměru jednotek pro nižší a vyšší dávku. Připraví se taková dávka zkoušeného přípravku, aby v objemu 0,1 ml až 0,5 ml obsahovala dvacetinásobek tohoto průměru v mezinárodních jednotkách kortikotropinu. Dávky se vstřikují v pravidelných intervalech 10 min až 15 min, přičemž dvě dávky porovnávacího roztoku tvori s dávkou zkoušené látky jednu skupinu o třech dávkách. Pořadí vstřikovaných dávek v následujících skupinách se náhodně střídá, až se vytvoří čtyři až pět skupin (dvanáct až patnáct dávek celkem). U každé dávky se změří maximální zvýšení krevního tlaku.

Průměrná hodnota odpovědi u zkoušené látky je menší než hodnota geometrického průměru obou dávek referenčního přípravku (5 m.j. presorické účinnosti na 100 m.j. účinnosti kortikotropinu).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 7, 0 %; stanoví se ve vakuové sušárně při 60 °C a při tlaku nepřekračujícím 670 Pa.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše nejvýše 318 m.j. endotoxiny v miligramu.

Stanovení účinnosti

Mezinárodní jednotka kortikotropinu je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nalezená hodnota účinnosti je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Stanovení účinnosti se provádí metodou A nebo B.

1. Provede se stanovení účinnosti kortikotropinu (2.7.3). Zvířata, u kterých byly provedena hypofyzektomie, mohou být nahrazena zvířaty, u kterých byla endogenní kortikotropní aktivita potlačena vhodnou látkou, např. dexamethasonem podávaným následujícím způsobem: každému zvířeti se vstříknou dvě dávky, každá po 0,5 ml, suspenze obsahující 2 mg dexamethasonu a arabskou ldovatinu (50 g/l). První dávka se vstříkne podkožně 18 h před zahájením zkoušky, druhá dávka se vstříkne intraperitoneálně současně se zkoušenou látkou. Mezi oběma parenterálními dávkami dostávají zvířata pitnou vodu s dexamethasonem (20 µg/ml) a glukosou (50 g/l).
2. Účinnost kortikotropinu se stanoví za daných podmínek porovnáním zvýšené tvorby kortikosteronu produkovaného izolovanými buňkami nadledvin potkanů s mezinárodním standardem nebo s referenčním přípravkem kalibrovaným v mezinárodních jednotkách.

Použij e se silikonované sklo před použitím dobře vymyté vodou R. Šetrným způsobem bez stresu se usmrtí 4 laboratorní potkani, samci o hmotnosti 200 g až 400 g. Vyjmou se nadledviny, opatrně očistí od okolní tukové tkáně a vloží do roztoku B uchovávaného při 4 °C. Každá žláza se rozkrojí na čtyři stejné díly a přenese do vhodného míchacího zařízení z plastické hmoty (viz obrázek 1), ve kterém je 5 ml roztoku C udržovaného při 37 °C. Buňky nadledvin se dispergují mícháním směsi při 500 ot/min. Po 20 min se odstraní supernatant, ochladí na 4 °C, přidá se 5 ml roztoku C a znovu míchá. Tento postup se opakuje ještě třikrát. Všech pět supernatantů se spojí a odstřed'uje 30 min v polyethylenových zkumavkách při 4 °C při postupném zvyšování rychlosti do 100 gn. Sediment se suspenduje v 8 ml roztoku D a odstřed'uje 30 min při 100 g/l Získaný sediment se znovu suspenduje v 8 ml roztoku D, směs se filtruje přes nylonovou síťku s otvory 100 µm do polyethylenové kádinky a k filtrátu se přidá vhodný objem roztoku D (bylo zjištěno, že vhodný celkový objem filtrátu je mezi 65 ml až 105 ml). Výsledný buněčný roztok se uchovává při 4 °C.

Ze zkoušeného roztoku o vhodné koncentraci a z porovnávacího roztoku se připraví s ředícím roztokem E čtyři koncentrace v geometrické řadě s dvojnásobným ředěním. 0,1 ml z každého zředění se pipetuje do čtyř polystyrenových zkumavek a do každé zkumavky se přidá 1,0 ml výše připravené buněčné suspenze. Zkumavky se inkubují 2 h při 37 °C a pak ochladí na 4 °C. 1 ml obsahu každé zkumavky se přenese do skleněných zkumavek obsahujících 1,4 ml dichlormethanu R, směs se promíchá 10 s na vířivé míchačce a odstřed'uje 5 min při 3000 gn. 1 ml dichlonnethanové vrstvy z každé zkumavky se přenese, bez porušení vodné vrstvy, do skeněných zkumavek obsahujících 0,6 ml směsi objemových dílů lihu 96% R a kyseliny sírové R (15 + 35). Směs se 10 s míchá na vířivé míchačce, odstřed'uje 5 min při 1500 g„a nechá 30 min stát. Fluorimetricky (2.2.21) se stanoví iradiace spodní vrstvy při excitační vlnové délce 436 nm nebo 470 nm a fluorescence se měří v maximu mezi 530 nm a 545 nm. Jestliže roztoky nejsou při měření přeneseny do kyvet, je nutné vybrat zkumavky, v nichž se fluorescenční hodnoty pro standard kortikosteronu neliší mezi sebou více než o 5 %.

Výsledky stanovení se počítají obvyklými statistickými metodami. Použije se lineární část křivky závislosti odpovědi na 10g dávky.

Výše uvedené látky se rozpustí přibližně v 950 ml vody R, pH roztoku se upraví lrydroxidem sodným 1 mol/l RS na 7,4, přidá se 60 mg sodné soli benzylpenicilinu R a takové množství streptomyciniumsulfatu R, které odpovídá 100 mg streptomycinu. Pak se roztok zředí vodou R na 1000 ml.

Roztok B. K roztoku A se přidá glukosa R (2 g/l).

Roztok C. K roztoku B se přidá kolagenasa získaná z Clostridium histolyticum a dostatečně čistá pro přípravu dispergovaných buněk (1 g/l).

Roztok D. K roztoku B se přidá albumin hovězí R (5 g/l).

Roztok E. Ke sterilnímu roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se přidá albumin hovězí R (1 g/l) a pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na 2,0.

Obr. 1.

Rozměry v milimetrech

A - kladka a míchací lopatka

B - ložisko

C - inkubační roztok

Uchovávání

V dobře uzavřeném obalu chráněn před světlem, při teplotě nepřevyšující 25 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• způsob podání při stanovení účinnosti (při použití zkoušky A),
• zda je látka sterilní,
• zda je látka prostá bakteriálních endotoxinů.