Erythropoietini solutio concentrata
1999
Koncentrovaný roztok erytropoetinu
| Mr asi 30 600 | CAS 113427-24-0 |
Je to roztok obsahující skupinu blízce příbuzných glykoproteinů, které nejsou rozlišitelné od přirozeného lidského erythropoetinu (urinární erythropoetin), co se týká pořadí 165 aminokyselin a jejich průměrného profilu glykosylace, v koncentraci 0,5 mg/ml až 10 mg/ml. Může také obsa hovat tlumivé soli a jiné pomocné látky. Má účinnost nejméně 100 000 m.j. v miligramu; stanoveno za podmínek uvedených v odstavcích Stanovení účinnosti a Bílkoviny.
Vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.
Výroba
Erytropoetin se připravuje in vitro v buňkách hlodavců metodou založenou na rekombinaci DNK.
Před propuštěním se na každé šarži provedou následující zkoušky, pokud oprávněná autorita neudělí výjimku.
Bílkoviny hostitelské buňky. Požadavek stanoví oprávněná autorita.
DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek stanoví oprávněná autorita.
Vlastnosti
Čirý nebo slabě opalizující bezbarvý roztok.
Zkoušky totožnosti
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se odsolí vhodným postupem, např. se zředí vodou R tak, aby se získala koncentrace 1 mg/ml. Vhodný objem zředěného roztoku se přenese do systému membránové filtrace pro odsolení bílkovin a vzorek se odsolí podle návodu výrobce. Odsolený vzorek se zředí na původní objem vodou R.
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí ve vodě R tak, aby získaná koncentrace byla 1 mg/ml. Provede se odsolení způsobem uvedeným pro zkoušený roztok.
Porovnávací roztok (b).Připraví se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5 podle návodu výrobce.
Izoelektrická fokusace se provede na tenké vrstvě polyakrylamidového gelu o tloušťce vrstvy 0,5 mm obsahujícího amfolyty pokrývající pH v rozmezí 3 až 5, které se připraví následujícím způsobem. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 9 g močoviny R, 6,0 ml akrylamidu bisakrylamidu (36,5 : 1) 30°lo RS, 1,05 ml amfolytu (o pH 3 až 5), 0,45 ml amfolytu (o pH 3 až 10) a 13,5 ml vody R. Po odplynění se přidá 15 µl tetramethylethylendiaminu R a 0,3 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
Gel se nalije do vhodného gelového rámečku o velikostí 15 cm x 15 cm x 0, 05 cm, vloží se vhodný hřeben na vytváření jamek pro vzorky a nechá se polymerovat.
Jako anodický roztok se použije anolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až S R a jako katodický roztok se použije katolyt pro izoelektrickou fokusaci o pH 3 až 5 R. Prefokusace probíhá 1 h při konstantním výkonu 10 W s nastaveným nejvyšším napětím 2000 V a proudem 100 mA.
Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 µl každého roztoku. Fokusace pokračuje za stejných podmínek dalších 30 min. Gel se vyjme z fokusační komory a umístí se do 200 ml roztoku obsahujícího kyselinu sulfosalicylovou R (35 g/l) a kyselinu trichloroctovou R (100 gn) v odbarvovacím roztoku RS. Za mírného pohybu se odbarvuje 30 min při pokojové teplotě. Roztok se odstraní a přidá se opět 200 ml odbarvovacího roztoku RS. Za pohybu se odbarvuje 1 h a pak se gel vysuší a přidá se 200 ml barvícího roztoku modři kyselé RS, nechá se stát 30 min a pak se odbarvuje pasivní difuzí v odbarvovacím roztoku RS, dokud nejsou dobře zřetelné zóny na čirém pozadí.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zbn na elektroforeogramti~ porovnávacího roztoku (b) odpovídá požadavkům výrobce na kalibraci izoelektrického bodu a elektroforeogram porovnávacího roztoku (a) odpovídá referenčnímu elektroforeogramu Ph. Eur. izoforem erytropoetinu. Je-li to nutné, nastavování a trvání napětí se může měnit tak, aby došlo k optimálnímu rozdělení izoforem. Identifikují se zóny odpovídající izoformám 2 až 7.
Rozsah pH pásů na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Hlavní zóny odpovídají izoformám 4,5 a 6. Slabší zóny odpovídající izoformám 2,3 a 7 mohou být též přítomny. Jiné zóny mohou být přítomny ve stopovém množství.
Zkouška se provede na polyakrylamidovém gelu o síle 0,75 mm a ploše asi 16 cm2. Rámeček na gel se složí podle návodu výrobce.
Separační gel. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 8,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 5 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 8,8 (1,5 mol/l), 6,6 ml vody R a 0,2 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 8 µl tetramethylethylendiaminu R a 0,2 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
Separační gel se nanese do sestaveného zařízení a nechá se dostatečný prostor pro zaostřovací gel. Gelový roztok se překryje 2-propanolem R a nechá se zpolymerovat.
Zaostřovací gel. V lahvi s postranním tubusem se smíchá 1,0 ml akrylamidu-bisakrylamidu (29 : 1) 30% RS, 0,75 ml tlumivého roztoku trometamolového o pH 6,8 (1 mohl), 4,1 ml vody R a 0,06 ml roztoku laurylsíranu sodného R (100 g/l). Po odplynění se přidá 6 µl tetramethylethylendiaminu R a 0,06 ml čerstvě připraveného roztoku peroxodisíranu diamonného R (100 g/l).
2-propanol R se odstraní ze zpolymerovaného separačního gelu a na separační gel se naleje roztok zaostřovacího gelu. Dobře se uzavře a nechá se polymerovat.
Roztok pro vzorky. Smíchají se stejné objemové díly SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS a vody R.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí ve vodě R tak, aby výsledná koncentrace byla 1,0 mg/ml. K jednomu objemovému dílu tohoto roztoku se přidá stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS.
Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky. Porovnávací roztok (a). Obsah jedné ampule erytropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Přidá se stejný objemový díl SDS-PAGE koncentrovaného roztoku pro vzorky RS. Porovnávací roztok (b). K 0,1 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,9 ml roztoku pro vzorky. Porovnávací roztok (c). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD do 70 kD. Porovnávací roztok (d). Použije se roztok předbarvených standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy v rozmezí 10 kD až 70 kD a vhodných pro přenos elektronů na vhodnou membránu.
Připravený gel se vloží do přístroje a přidá se přiměřený objem SDS-PAGE elektrodového roztoku RS. Zkoušené a porovnávací roztoky uchovávané v dobře uzavřených zkumavkách se na 2 min vloží do vroucí vodní lázně. Po 20 lr, l každého roztoku se nanese do jamek zaostřovacího gelu v následujícím pořadí: porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a), zkoušený roztok (a), prázdná jamka, porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b), porovnávací roztok (d). Elektroforéza probíhá za podmínek doporučených výrobcem zařízení. Na konci separace se vyjme rámeček a gel se rozdělí na dvě části. První část obsahuje porovnávací roztok (c), porovnávací roztok (a) a zkoušený roztok (a); druhá část obsahuje porovnávací roztok (b), zkoušený roztok (b) a porovnávací roztok (d).
První část gelu se umístí do barvícího roztoku modři kyselé RS a pohybuje se jím 1 h. Pak se gel přenese do odbarvovacího roztoku RS a nechá se v něm odbarvóvat za pohybu, dokud nejsou zřetelně viditelné zóny bílkoviny na čirém pozadí. Zkoušku Ize hodnotit, jestliže bílko viny standardů molekulových hmotností jsou rozděleny do zřetelně oddělených zón, s přibližně lineární závislostí vzdálenosti migrace na log10 molekulové hmotnosti. Elektroforeogram zkoušeného roztoku (a) ukazuje jedinou difuzní zónu odpovídající polohou a intenzitou jediné zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
Druhá část gelu se vloží na membránu, která slouží k imobilizaci bílkovin, použije se komerčně dostupné zařízení pro elektroblot a postupuje se podle návodu výrobce. Po elektroblotu se membrána inkubuje 1 h až 2 h v neutrálním izotonickém tlumivém roztoku obsahujícím vhodné srážecí činidlo, např. sušené mléko (50 g/l) nebo fetální telecí sérum 10% (VN), a poté následuje inkubace 1 h až 14 h ve stejném srážecím roztoku s vhodně naředěnou polyklonální nebo monoklonální anti-erytropoetinovou protilátkou. Erytropoetin vázaný na protilátku se deteguje za použití vhodné protilátky značené enzymem nebo radioaktivně vázaným zkoumadlem (např. alkalická fosfatasa konjugovaná s druhou protilátkou). Přesné detaily o srážecích činidlech, koncentracích a inkubačních dobách by se měly optimalizovat za použití základních údajů popsaných v Imunochemických metodách (2.7.1).
Zkoušku lze hodnotit, jestliže jsou na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (d) rozděleny zóny standardů molekulových hmotností do přesných zón, s přibližně lineární závislostí vzdálenosti migrace na 10glo molekulové hmotnosti.
Elektroforeogram zkoušeného roztoku (b) tvoří jedinou difuzní zó iú odpovídající polohou a intenzitou zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b).
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem trisacetatovým o pH 8,5 na koncentraci 1,0 mg/ml. Rovnováha roztoku se upraví za použití tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 vhodným postupem (např. dialýza do tlumivého roztoku trisacetatového o pH 8,5 nebo membránová filtrace, která je popsána v odstavci Zkoušky totožnosti B, ale odsolený vzorek se rozpustí v tlumivém roztoku trisacetatovém o pH 8,5). Dialyzovaný roztok se převede do polypropylenové zkumavky ná odstřed'ování. 5 µl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) ve vodě R se přidá k 0,25 ml zkoušeného roztoku. Zkumavka se uzavře a vloží se na 18 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se vzorek vyjme z vodní lázně a reakce se ihned přerušf zmrazením.
Porovnávací roztok. Obsah jedné ampule erythropoetinu BRP se rozpustí v 0,25 ml vody R. Dále se tento roztok zpracovává současně stejnými postupy a za stejných podmínek jako zkoušený roztok.
Oba enzymaticky štěpené roztoky se zkouší kapalinovou chromatografií (2.2.29).
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
| Čas (min) |
Průtoková rychlost (ml/min) |
Mobilní fáze A % (V/V) |
Mobilní fáze B % (V/V) |
Poznámka |
|---|---|---|---|---|
| 0 - 10 | 0,75 | 100 | 0 | izokraticky |
| 10 - 125 | 0,75 | 100 → 39 | 0 → 61 | lineární gradient |
| 125 - 135 | 1,25 | 39 → 17 | 31 → 83 | lineární gradient |
| 135 - 145 | 1,25 | 17 → 0 | 83 → 100 | lineární gradient |
| 145 - 150 | 1,25 | 100 | 0 | ustalování |
Kolona se nejméně 15 min ustaluje za počátečních podmínek. Provede se slepá zkouška za výše zmíněného gradientu.
Nastříkne se 50 µl zkoušeného roztoku a 50 µl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy jednotlivých roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného erythropoetinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.
Provede se Edmanovo odbourávání za použití automatického sekvetátoru v pevné fázi v souladu s návodem výrobce.
Odsolí se množství odpovídající 50 Ftg erytropoetinu, např. zředí se takový objemový díl zkoušeného přípravku odpovídaj ící 50 Wg účinné látky v 1 ml roztoku kyseliny trifluoroctové R 0,1% (VN). Nejdříve se promyje preparativní kolona C18 reverzní fází podle doporučení vý robce a ustálí se v kyselině trifluoroctové R 0,1% (VN). Přidá se vzorek na kolonu a promývá se postupně řadou směsí kyseliny trifluoroctové R 0,1 % (VN) s acetonitrilem R (0% (VN), 10% (VN) a 50% (VN)) podle doporučení výrobce. 50% acetonitrilový eluát se lyofilizuje.
Odsolený vzorek se opět rozpustí v 50 µl kyseliny trifluoroctové R 0,1 % (VN) a převede se do dělicí kolony podle návodu výrobce. Nechá se probíhat 15 cyklů rozdělování, při druhém a třetím cyklu se použijí reakční podmínky pro proliv.
Při každém rozdělovacím cyklu se provede zkouška totožnosti aminokyselin uvolněných fenylthiohydantoinem (dále PTH-aminokyselin) reverzně fázovou kapalinovou chromatografií. Postup může být proveden za použití kolon a zkoumadel doporučených výrobcem zařízení na separaci PTH-aminokyselin.
Separační postup by měl být kalibrován za použití:
Prvních 15 aminokyselin je:
alanin - proliv - proliv - arginin - leucin - isoleucin - (nereprodukovatelný pík) - kyselina asparagová - serin - arginin - valin - leucin - kyselina glutamová - arginin - tyrosin.
Zkoušky na čistotu
Bílkoviny. Stanoví se absorpční spektrofotometrií v ultrafialové oblasti (2.2.25).
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem hydrogenuhličitanu amonného R (4 g/l) na výslednou koncentraci 1 mg/ml.
Měří se absorbance při 250 nm až 400 nm. Roztok vykazuje absorpční maximum při 276 nm až 280 nm. Pro korekci možného rozptylu světla se měří zákal při 400 nm. Koncentrace erytropoetinu se vypočítá s použitím specifické absorbance, jejíž hodnota je 7,43. Koncentrace erytropoetinu je 80 % až 120 % deklarované koncentrace.
Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).
Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází na koncentraci 0,2 mg/ml. Porovnávací roztok. K 0,02 ml zkoušeného roztoku se přidá 0,98 ml mobilní fáze.
Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:
Nastříkne se 100 µl zkoušeného roztoku a 100 µl porovnávacího roztoku. Chromatogram se zaznamenává nejméně 1 h. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků eluovaných před hlavním pikem není větší než plocha hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (2 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže plocha hlavního píku na ehromatogramu porovnávacího roztoku je 1,5 % až 2,5 % plochy hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku.
Kyselina sialová.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností, na koncentraci 0,3 mg/ml.
Zkoušený roztok (b). K 0,5 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 0,5 ml mobilní fáze, která byla použita ve zkoušce Dimery a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností.
Porovnávací roztok (a). Vhodné množství kyseliny sialové R se rozpustí ve vodě R na koncentraci 0,1 mg/ml.
Porovnávací roztok (b).K 0,8 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0, 2 ml vody R. Porovnávací roztok (c). K 0,6 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,4 ml'vody R. Porovnávací roztok (d). K 0,4 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,6 ml vody R. Porovnávací roztok (e). K 0,2 ml porovnávacího roztoku (a) se přidá 0,8 ml vody R. Porovnávací roztok (f). Použije se voda R.
Provede se trojí stanovení. Převede se 100 µl každého zkoušeného a porovnávacího roztoku do 10ml skleněných zkumavek. Do každé zkumavky se přidá 1, 0 ml zkoumadla resorcinolového R. Zkumavky se uzavřou a nechají se 30 min při teplotě 100 °C. Po ochlazení ledem se do každé zkumavky přidají 2,0 ml směsi objemových dílů butanolu R a octanu butylnatého R (12 + 48). Intenzívně se promíchá a nechají se oddělit dvě fáze. Pokud je horní fáze zcela čirá, opatrně se oddělí spodní fáze a odstraní se. Měří se Absorbance (2.2.25) všech roztoků při 580 nm. Z kalibrační křivky vytvořené porovnávacími roztoky se stanoví obsah kyseliny sialové v obou zkoušených roztocích a vypočítá se průměrná hodnota. Při výpočtu počtu molů kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu se bere v úvahu, že:
Zkoušený přípravek obsahuje nejméně 10 mol kyseliny sialové v 1 molu erytropoetinu. Zkoušku lze hodnotit, jestliže jednotlivé stanovení je v rozsahu ±10 % a pokud hodnota porovnávacího roztoku (a) je 1, Snásobek až 2,5násobek zkoušeného roztoku (a).
Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 20 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 100 000 m.j. erytropoetinu.
Stanovení účinnosti.
Účinnost přípravku se porovnává s účinností erytropoetinu BRP a vyjadřuje se v mezinárodních jednotkách (m.j.).
Stanovená účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Meze spolehlivosti stanovené účinnosti (P = 0,95) jsou 64 % až 156 % deklarované účinnosti.
Stanovení účinnosti se provede metodou A nebo B.
Účinnost přípravku se stanoví v daných podmínkách hodnocením jeho působení na stimulaci příjmu 59Fe červených krvinek myší, které byly vystaveny sníženému atmosférickému tlaku a staly se polycytémickými.
Následující plán, užívající podtlakovou komoru, se ukázal být vhodným.
Polycytémie se vyvolá u samic myší stejného kmene a hmotnosti 16 g až 18 g. Samice myší se umístí do podtlakové komory o tlaku 0,6 atm. Po 3 dnech při 0, 6 atm se tlak sníží na 0,4 atm až 0,5 atm, při kterém se zvířata nechají dalších 11 dní. (Částečné vakuum je denně přerušeno na maximálně 1 h okolo 11.00 h k zajištění úklidu klecí a potravy pro zvířata.) Po skončení tohoto specifického období se myši vrátí do normálních atmosférických podmínek. Namátkově se rozdělí do klecí po šesti zvířatech a označí se.
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.
Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 0,2 m.j./ml.
Porovnávací roztok (b).Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7, 2 (1).
Porovnávací roztok (c) Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1 ).
Radioaktivně značený roztok chloridu železitého (koncentrovaný) SvFe. Použije se vyráběný 59Fe-chlorid železitý (o specifické aktivitě 100 MBq až 1000 MBq na miligram Fe).
Radioaktivně značený roztok chloridu železitého SvFe. Radioaktivně značený koncentrovaný roztok chloridu železitého se zředí tlumivým roztokem citronanovým o pH 7,8 na aktivitu 3,7 x 104 Bq/ml. Koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.
Tři dny po návratu zvířat do atmosférického tlaku se každému zvířeti podkožně vstříkne 0,2 ml jednoho roztoku. Ze šesti zvířat v každé kleci se každému zvířeti podá jeden ze šesti různých roztoků (3 zkoušené roztoky a 3 porovnávací roztoky) a pořadí injekcí by mělo být pro každou klec náhodně určeno. Nejméně se doporučuje n = osm (osm klecí).
Dva dny po injekci zkoušeného nebo porovnávacího roztoku se každému zvířeti intraperitonálně vstříkne 0,2 ml radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého 59Fe. Pořadí injekcí je stejné jako při podání erytropoetinu a doba mezi podáním erytropoetinu a radioaktivně značeného roztoku chloridu železitého je pro každé zvíře stejná.
Za dalších 48 h se každé zvíře uspí injekcí vhodného anestetika, zaznamená se tělesná hmotnost a z rozvětvení aorty se odeberou vzorky krve (0,65 ml) do hematokritových kapilár. Po určení objemu sražených buněk se změří radioaktivita každého vzorku.
Pro každou myš se vypočítá odezva (% 59Fe v celkovém krevním oběhu) podle vztahu:
| As · M · 7,5 | , |
| At · Vs |
v němž značí:
As - radioaktivitu vzorku,
At - celkovou podanou aktivitu,
7,5 -
celkový objem krve v procentech tělesné hmotnosti,
M - tělesnou hmotnost v
gramech,
Vs - objem vzorku.
Účinnost se vypočítá obvyklými státistickými metodami vhodnými pro model rovnoběžnosti. Z výpočtu se vyloučí zvíře, jehož objem sražených buněk je méně než 54 % nebo tělesná hmotnost je více než 24 g.
Zkouška je založena na měření stimulace tvorby retikulocytů u normocytémických myší. Zkouška se může provést následujícím postupem:
Zkoušený roztok (a). Zkoušený přípravek se zředí tlumivým roztokem fosforečnan-albuminovým o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.
Zkoušený roztok (b). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1 ).
Zkoušený roztok (c). Smíchají se stejné objemové díly zkoušeného roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7,2 (1).
Porovnávací roztok (a). Erytropoetin BRP se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnan-albuminovém o pH 7,2 (1) na koncentraci 80 m.j./ml.
Porovnávací roztok (b).Smíchají se stejné objemové díly porovnávacího roztoku (a) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7, 2 (1 ).
Porovnávací roztok (c). Smíchají se stejné objemové dfly porovnávacího roztoku (b) a tlumivého roztoku fosforečnan-albuminového o pH 7, 2 (1).
Přesné koncentrace zkoušených roztoků a porovnávacích roztoků se mohou změnit podle odezvy použitých zvířat.
Na začátku zkoušení se náhodně rozdělí myši vhodného věku a kmene (jsou vhodné 8 týdnů staré myši B6D2F1) do šesti klecí. Doporučuje se nejméně n = 8 (počet myší v kleci). Každému zvířeti se podkožně vstříkne 0,5 ml příslušného roztoku (1 roztok na klec) a zvíře se umístí v nové kleci. Myši se střídají tak, aby každá klec obsahovala šest myší, z nichž každé byl podán jiný roztok (tj. jeden ze tří zkoušených nebo tří porovnávacích roztoků).
Za 4 dny po injekci se odeberou vzorky krve zvířat a stanoví se počet retikulocytů vhodným způsobem. Může se použít následující metoda:
Objem krve, postup ředění a fluorescenční látka mohou být změněny k dosaiení maximální a stabilní fluorescence.
Barvící roztok (koncentrovaný). Použije se roztok thiazolové oranže vhodné pro stanovení retikulocytů. Připraví se dvojnásobná koncentrace, než je třeba pro analýzu.
Provádí se následující ředění. Plná krev se SOOkrát zředí tlumivým roztokem použitým k přípravě barvícího roztoku. Tento roztok se koncentrovaným barvícím roztokem zředí na dvojnásobný objem. Po 3 min až 10 min barvení se stanoví mikrofluorimetricky počet retikulocytů v průtokovém cytometru. Procento retikulocytů se určí použitím biparametrického histogramu: počet buněk a červená fluorescence F1 (620 nm).
Účinnost se vypočítá obvyklými statistickými metodami pro model rovnoběžnosti.
Uchovávání
Uchovává se ve vzduchotěsných obalech při teplotě pod -20 °C. Je třeba se vyvarovat opakovaného zmrazení a rozmrazení.
Separandum.
Označování
V označení na obalu se uvede: