Gonadorelinum

Gonadorelin

GIu1-lis-TrFrSer-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GIy-NFiz

Je to peptid hypotalamu povzbuzující uvolnění hormonu stimulujícího folikuly a luteinizačního hormonu z hypofýzy. Počítáno na bezvodou látku, obsahuje 88,0 % až 98,0 % peptidu C₅₅H₇₅N₁₇O₁₃. Získává se syntézou a je používán také ve formě octanu nebo chloridu.

Vlastnosti

Bílý nebo slabě nažloutle bílý prášek. Je rozpustný ve vodě a v 1 % (V/V) roztoku kyseliny octové ledové, mírně rozpustný v methanolu.

Zkoušky totožnosti

1. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Poloha hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá hlavnímu píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
2. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušelo A a B na Příbuzné peptidy. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztolou (b) odpovídá polohou a veliloostí hlavní slovrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Roztok (10 g/l) je čirý (2.2.1) a není intenzívněji zbarven než porovnávací barevný roztok Ž5 (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -54 ° až -63 °, přepočteno na stanovený obsah peptidu. Měří se roztok připravený rozpuštěním 10 mg v 1,0 ml roztoku kyseliny octové ledové R 1 % (V/V).

Absorbance. 10 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 100,0 ml. Absorbance (2.2.25) měřená v maximu při 278 nm je 0,55 až 0,59, přepočteno na stanovený obsah peptidu.

Aminokyseliny. Stanoví se analyzátorem aminokyselin za použití DL-norleucinu R jako vnitřního standardu. Přístroj se nastaví směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a L-forem následujících aminokyselin: lysin, histidin, arginin, kyselina asparagová, threonin, serin, kyselina glutamové, proliv, alanin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin a fenylalanin, a polovinu ekvimolárního množství L-cystinu.

Roztok vnitřního standardu. 30 mg DL-norleucinu R se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny chlorovodíkové R a vody R a zředí se touto směsí na 100,0 ml.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se naváží do pečlivě vymyté zkumavky z tvrzeného skla délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se přesně oďměřený objem roztoku vnitřního standardu obsahující takové množství DL-norleucinu R, které odpovídá polovičnímu očekávanému množství molů gonadorelinu. Zkumavka se vloží do mrazicí směsi při -5 °C, tlak se sníží pod 0,1331cPa a zkumavka se těsně uzavře. Poté se 16 h zahřívá na 110 °C až 115 °C. Zkumavka se po ochlazení otevře a její obsah se převede do l Oml odměrné baňky pomocí pěti dávek vody R, každé po 0,2 ml. Vysuší se za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R, zbytek se rozpustí ve vodě R a znovu se vysuší za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R a potom se tento postup ještě jednou opakuje. Zbytek se rozpustí ve vhodném tlumivém roztoku o pH 2,2 a zředí se jím na vhodný objem.

Do analyzátoru aminokyselin se přesně odměří vhodné množství zkoušeného roztoku tak, aby píky aminokyselin přítomných ve větších množstvích zaujímaly většinu stupnice záznamu. Obsah jeďnotlivých aminokyselin se vyjádří v molech. Relativní zastoupení aminokyselin se vypočítá z předpokladu, že jedna sedmina součtu molů histidinu, kyseliny glutamové, leucinu, prohnu, glycinu a argininu se rovná 1. Hodnoty pro jednotlivé aminokyseliny jsou v těchto rozmezích: serin 0,7 až 1,05; kyselina glutamové 0,95 až 1,05; proliv 0,95 až 1,05; glycin 1,9 až 2,1; leucin 0,9 až 1,1; tyrosin 0,7 až 1,05; histidin 0,95 až 1,05; arginin 0,95 až 1,05. Lysin a isoleucin nejsou přítomny, ostatní aminokyseliny jsou přítomny jen ve stopách.

Stanovení lze hodnotit, neliší-li se nalezený počet molů norleucinu po opravě na množství použitého roztoku o více než f5 % od množství přidaného ke zkoušené látce před hydrolýzou.

Příbuzné peptidy.

1. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy silikagelu G R.

   Zkoušený roztok (a). 5,0 mg se rozpustí v 0,5 ml vody R.

   Zkoušený roztok (b). 100 µl zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 1,0 ml. Porovnávací roztok (a). 20 µl zkoušeného roztoku (a) se zředí vodou R na 1,0 ml. Porovnávací roztok (b). 1,0 mg gonadorelinu CRL se rozpustí v 1,0 ml vody R.

   Na vrstvu se nanese po 10 µl z každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů chloroformu R, methanolu R, vody R a kyseliny octové ledové R (60 + 45 + 14 + 6) po dráze 15 cm. Vrstva se 5 min suší. Na ďno chromatografické komory se vloží odpařovací miska se směsí 10 ml roztoku manganistanu draselného R (50 g/l) a 3 ml kyseliny chlorovodíkové R, komora 1786 f Gonadotropinum chorionicum

   Se uzavře a nechá se stát. Do komory se vloží suchá vrstva a komora se uzavře. Za 2 min působení chloru se vyjme a vloží se do proudu chlaďného vzduchu na tak dlouho, dokud se neodstraní přebytek chloru a plocha pod místy nanesení roztoků nedává již modré zbarvení s 0,05 ml skrobu s jodidem draselným RS. Vrstva se postříká škrobem s jodidem draselným RS. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzívnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (2,0 %).

2. Provádí se shodně jako postup A, ale za použití jiné mobilní fáze, jíž je směs objemových dílů amoniaku 26 % RS, methanolu R a chloroformu R (20 + 45 + 60). Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzívnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (2,0 %).

Voda. Nejvýše 7,0 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28), za použití methanolu bezvodého R jako vnitřního standardu. Použ~e se suché sklo, které se může ošetřit silikonem.

Roztok vnitřního standardu. 50 µl methanolu bezvodého R se smíchá s 2 propanolem RI a zředí se jím na 100 ml.

Zkoušený roztok (a). 4,0 mg se rozpustí v 1,0 ml 2 propanolu Rl.

Zkoušený roztok (b). 4,0 mg se rozpustí v 1,0 ml roztoku vnitřního standardu. Porovnávací roztok. K 50 ml roztoku vnitřního standardu se přidá 10 µl vody R.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 1 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné styrendivinylbenzenkopolymerem R (180µm až 250 µm),
• helia pro chromatografii R jako nosného plynu,
• tepelně vodivostního detektoru,

Teplota kolony se udržuje při 120 °C a detektoru při 150 °C.

Nastříkne se vhodné množství každého roztoku. Obsah vody se vypočítá za předpokladu, že hustota vody (2.2.5) při 20 °C je 0,9972 g/ml a odečte se množství vody stanovené v roztoku vnitřního standardu.

Kyselina octová. Je-li přípravek ve formě octanu, vyhovuje následující dodatečné zkoušce. Nejvýše 7,5 %. Stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití dioxanu R jako vnitřního standardu.

Zkoušený roztok (a). 20,0 mg se rozpustí v 1,0 ml vody R.

Zkoušený roztok (b). 20,0 mg se rozpustí v 1,0 ml vody R a přidá se 10 µl dioxanu R. Porovnávací roztok. 1,0 mg kyseliny octové ledové R se zředí 1,0 ml vody R a přidá se 10 µl dioxanu R.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• skleněné kolony délky 2 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné ethylvinylbenzen-divinylbenzen kopolymerem R (125 µm až 180 µm),
• dusíku pro chromatografii R jako nosného plynu,
• plamenoionizačního detektoru.

Teplota kolony se udržuje při 150 °C.

Chloridy (2.4.4). Je-li přípravek ve formě hydrochloridu, vyhovuje následující dodatečné zkoušce. Nejvýše 6 %. 0,83 mg se rozpustí v 15 ml vody R. Roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy.

Stanovení obsahu

Stanovení se provede kapalinovou chromatografií (2.2.29).

Zkoušený roztok. 1,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a roztoku kyseliny fosforečné (10 g/l), jejíž pH bylo triethylaminem R upraveno na 3,0, (15 + 85) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Porovnávací roztok. 1,0 mg gonadorelinu CRL se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a roztoku kyseliny fosforečné (10 g/l), jejíž pH bylo triethylaminem R upraveno na 3,0, (15 + 85) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml,

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, která je směsí objemových dílů roztoku kyseliny fosforečné (10 g/l), jejíž pH bylo triethylaminem R upraveno na 3,0, a acetonitrilu R (75 + 25); poměr složek směsi se upraví tak, aby retenční čas gonadorelinu byl asi 10 min,
• spektrofotometrického detektoru, 220 nm. Nastřikuje se odděleně 20 µl každého roztoku.

Obsah peptidu C₅₅H₇₅N₁₇O₁₃ se vypočítá porovnáním s deklarovaným obsahem C₅₅H₇₅N₁₇O₁₃ v gonadorelinu CPcL. Zkoušku lze hodnotit, dosahuje-li počet teoretických pater hodnoty nejméně 20 000 na metr.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• množství peptidů v obalu,
• podmínky uchovávání,
• zda je látka ve formě octanu nebo chloridu.