Interferoni gamma-lb solutio concentrata

2000

Koncentrovaný roztok interferonu gama-lb

Je to roztok N-terminální methionylové formy interferonu gama, bílkoviny, jež je vytvářena a vylučována lidskými T lymfocyty stimulovanými antigenem jako odpověd' na virové infekce a na různá jiná agens. Má specifické imunomodulační vlastnosti, jako např. silné účinky při aktivaci fagocytů.

Bílkovina se skládá z nekovalentních dimerů dvou identických monomerů. Vzorec monomeru

MQDPYVKEAEN LKKYFNAGHS DVADNGTLFL

GILKNWKEES DRKIMQSQIV SFYFKLFKNF

KDDQSIQKSV ETIKEDMNVK FFNSNICKKRD

DFEKLTNYSV TDLNVQRKAI HELIQVMAEL

SPAAKTGKRK RSQMLFRGR

Účinnost interferonu gama-lb je nejméně 20 . 106 m j. v miligramu bílkoviny. Koncentrovaný roztok interferonu gama-lb obsahuje nejméně 30 . 106 m:1. interferonu gama-lb v mililitru.

Koncentrovaný roztok interferonu gama-lb vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Výroba

Vyrábí se metodou založenou na rekombinantní DNK technologii za použití bakterií jako hostitelských buněk. Vyrábí se v podmínkách určených ke snížení kontaminace mikroby na minimum.

Vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům:

Bílkoviny odvozené z hostitelských buněk. Limit schvaluje oprávněná autorita.

DNK odvozená z hostitelských buněk nebo vektoru. Limit schvaluje oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirá bezbarvá nebo slabě nažloutlá tekutina.

Zkoušky totožnosti

1. Stanovení účinnosti je zároveň zkouškou totožnosti.
2. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Nečistoty lišící se od interferonu gama-lb molekulovými hmotnostmi. Hlavní pásy na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídají polohou hlavním pásům na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
3. Provede se peptidové mapování.

   Roztok A. Připraví se roztok obsahující trometamol R (1,2 g/l), octan sodný bezvodý R (8,2 gn) a chlorid vápenatý R (0,02 g/l) a jeho pH (2.2.3) se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 8,3. Přidá se polysorbát 20 R do koncentrace 0,1 % (VlV).

   Zkoušený roztok. Vhodným postupem se odsolí objem zkoušeného přípravku obsahující 1 mg bílkoviny. Např. se zfiltruje do mikrocentriµgační zkumavky a rekonstituuje se 500 pl roztoku A. Přidá se 10 µl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapováni R (1 mg/ml) ve vodě R a jemně se míchá kroužením. Inkubuje se 24 h při 30 °C až 37 °C, přidá se 100 pl kyseliny fosforečné R na mililitr rozštěpeného vzorku a míchá se kroužením. Porovnávací roztok. Interferon gama-1 b CRL se zředí vodou R na koncentraci 1 mg/ml. Postupuje se jako u zkoušeného roztoku a zajistí se, aby všechny postupy byly provedeny současně a ve stejných podmínkách.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29). Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   • nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního pnlměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (10 µm),
   • mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min:
     • mobilní fáze A - (tlumivý roztok fosforečnanový o pH 3,3 (0,05 mol/l)). Roztok I: 7,80 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Roztok II: 0,33 ml kyseliny fosforečné R se zředí vodou R na 100,0 ml. Smíchá se 920 ml roztoku I a 80 ml roztoku II. Je-li třeba, upraví se pH (2.2.3),
     • mobilní fáze B - acetonitril pro chromatografii R,
   • následujících podmínek eluce (je-li třeba, může se gradient upravit, aby se zlepšilo dělení rozštěpené látky):
     

     Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
     0 - 30	100 → 80	0 → 20
     30 - 50	80 → 60	20 → 40
     50 - 51	60 → 30	40 → 70
     51 - 59	30	70
     59 - 60	30 → 100	70 → 0

   • spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobihú fází s počátečním složením. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se 100 pl zkoušeného roztoku a 100 pl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže se chromatogramy obou roztoků kvalitativně podobají referenčnímu chromatogramu Ph.Eur. rozštěpeného interferonu gama-]b. Profil chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá profilu chromatogramu porovnávacího roztoku.

4. Provede se N-terminální sekvenční analýza. Použije se automatický sekvenátor v pevné fázi v souladu s návodem výrobce. Vhodným způsobem se ustálí ekvivalent 100 pg interferonu gama-lb v roztoku hydrogenuhdičitanu amonného R (10 g/l) o pH 9,0.

   Reverzní fází kapalinové chromatografie se identifikují fenylthiohydantoin (PHT)-aminokyseliny uvolněné při každém sekvenčním cyklu. Postup se může provést s použitím kolony a zkoumadel doporučenými výrobcem sekvenčního zařízení při separaci PHT-aminokyselin.

   Separační postup se kalibruje za použití:

   • směsi PHT-aminokyselin poskytnutým výrobcem s podmínkami gradientu nastavenými tak, jak se uvádí k získání nejlepšího rozložení všech aminokyselin,
   • vzorku ze slepého sekvenčního cyklu získaného podle doporučení výrobce zařízení. Prvních patnáct aminokyselin je: Met-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr.

Zkoušky na čistotu

Vzhled. Zkoušený přípravek je čirý (2.2.1) a není zbárven intenzívněji než porovnávací barevný roztok Ž, (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 4,5 až 5, 5; měří se zkoušený přípravek.

Kovalentnf dimery a oligomery. Nejvýše 2 %;stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30). Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí mobilní fází na koncentraci bílkovin 0,1 mg/ml. Porovnávací roztok (a). Interferon gama-I b CRL se zředí mobilní fází na koncentraci bílkovin 0,1 mg/ml. Porovnávací roztok (b). Připraví se směs následujících standardů molekulových hmotností: albumin hovězí, ovalbumin, trypsinogen, lysozym o koncentraci 0,1 mg/ml až 0,2 mg/ml pro každý standard.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R stupně vhodného pro frakcionaci globulárních bílkovin v rozpětí molekulových hmotností od 10 000 do 500 000 (5 μm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min, kterou je směs připravená následujícím postupem (tlumivý roztok fosforečnanu sodného o pH 6,8 (0,2 mol/l)). Roztok I: 31,2 g dihydrogenfosforečnanu sodného R a 1,0 g dodecylsiranu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Roztok II: 28,4 g hydrogenfosforečnanu sodného bezvodého R a 1,0 g dodecylsíranu sodného R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1000,0 ml. Smíchá se 450 ml roztoku I a 550 rnl roztoku II. 7e-li třeba, upraví se pH (2.2.3),
• spektrofotometrického detektoru, 210 nm až 214 nm.

Nastříkne se po 200 µl ze všech roztoků. Zkoušku lze hodnotit, jestliže: standardy molekulové hmotnosti porovnávacího roztoku (b) jsou zřetelně rozděleny; retenční čas hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je mezi retenčním časem trypsinogenu a lysozymu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Porovnají se chromatogramy zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (a). V porovnání s porovnávacím roztokem (a) není na zkoušeném roztoku žádná další prodleva ani pík.

Obsah kovalentních dimerů a oligomerů se vypočítá v procentech.

Monomery a agregáty. Nejvýše 2 %;stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Roztok A. Připraví se roztok kyseliny jantarové R (0,59 g/l) a mannitolu R (40 gn) a jeho pH (2.2.3) se upraví hydroxidem sodným RS na hodnotu 5,0.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí roztokem A na koncentraci bílkovin 1 mglml.

Porovnávací roztok. Interferon gama-1 b CRL se zředí roztokem A na koncentraci bílkovin 1 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Připraví se 500 µl směsi obsahující albumin hovězí R (0,04 mg/ml) a intetferon gama-]b CRL (0,2 mg/ml) v roztoku A. Tento roztok se použije do 24 h od přípravy.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 nun naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatografii R stupně vhodného pro frakcionaci globulárních bílkovin v rozpětí molekulových hmotností 10 000 až 300 000 (5 íxm),
• mobilní fáze, kterou je roztok chloridu draselného R 1,2 mol/l (89,5 g/l). Průtoková rychlost je 0,8 ml/min,  
• detektoru spektrofotometrického, 214 nm.

Nastříkne se 20 pl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu retenční čas hlavního píku odpovídá nativnímu dimeru interferonu gama-lb, asi 10 min; pík hovězího albuminu se eluuue při relativním retenčním čase asi 0,85 vzhledem k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky hovězího albuminu a interferonu gama1b je nejméně 1,5.

Nastříkne se 20 pl zkoušeného roztoku a 20 lrl porovnávacího roztoku. Získané chromatogramy vykazují hlavní píky se shodnými retenčními časy. Obsah monomeru a agregátů v procentech se vypočítá z plochy píku monomeru a píků, které se eluují před píkem nativního interferonu gama-lb na chromatogramu zkoušeného roztoku, obvyklým postupem (metodou normalizace). Nepřihlíží se k píkům rozpouštědla.

Deamidované a oxidované formy a heterodimery. Stanoví se kapalinovou chromatografií (2.2.29); obsah deamidovaných a oxidovaných forem je nejvýše 10 %, heterodimerů jsou nejvýše 3 %.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkovin 1 mg/ml. Porovnávací roztok. Interferon gama-1 b CRL se zředí vodou R na koncentraci bílkovin 1 mg/ml. Roztok pro rozlišení. Použije se validačni roztok interferonu gama-1 b CRL.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,075 m a vnitřního průměru 7,5 mm naplněné vhodným hydrofilním polymetha1Qylátem, silně kationty měnícím gelem (10 pm, 100 nm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,2 mllmin:
  • mobilní fáze A - (tlumivý roztok octanu amonného o pH 6,5 (0,05 mol/l)); roztok octanu amonného R (3,86 gn), jehož pH se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 6,5,
  • mobilní fáze B - (tlumivý roztok octanu amonného o pH 6,5 (1,2 mol/l)J; roztok octanu amonného R (92,5 g/l), jehož pH se upraví kyselinou octovou zředěnou RS na hodnotu 6,5,
• gradientového programu s následujícími podmínkami (je-li třeba, upraví se pro zlepšení separace stoupání gradientu):
  

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
  0 - 1	100	0
  2 - 30	100 → 0	0 → 100
  31 - 35	0	100
  36 - 37	0 → 100	100 → 0
  38 - 47	100	0

• spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

Teplota kolony se udržuje při 35 °C.

Nastříkne se 25 µl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 26 min. Deamidované a oxidované formy se eluují společně při relativním retenčním čase asi 0,95 vzhledem k hlavnímu píku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení definované poměrem výšky píku odpovídajícího deamidovaným a oxidovaným formám k výšce nad základní linií dělící oba píky je nejméně 1,2.

Nastříkne se 25 pl zkoušeného roztoku a 25 pl porovnávacího roztoku. Získané chromatogramy vykazují hlavní píky se shodnými retenčními časy. Obsah deamidovaného a oxidovaného interferonu gama-lb v procentech se vypočítá jako procenta z plochy hlavního píku. Relativní retenční čas heterodimerů je 0,7 až 0,85 vzhledem k hlavnímu píku. Obsah heterodimerů v procentech se vypočítá jako procenta ze součtu ploch všech píků.

Nečistoty lišící se od interferonu gama-lb molekulovými hmotnostmi. Stanoví se polyalaylamidovou gelovou elektroforézou (2.2.31). Zkouška se provádí za redukčních i neredukčních podmínek na rozlišovacích gelech s 15 akrylamidu; k detekci se používá barvení stříbrem.

Roztok pro vzorek (pro neredukční podmínky). 3,78 g trometamolu R, 10,0 g dodecylsíranu sodného R a 0,100 g modři bromfenolové R se rozpustí ve vodě R. Přidá se 50,0 ml glycerolu R a zředí se vodou R na 80 ml. Upraví se pH (2.2.3) kyselinou chlorovodíkovou R na hodnotu 6,8 a zředí se vodou R na 100 ml.

Roztok pro vzorek (pro redukční podmínky). 3,78 g trometamolu R, 10,0 g dodecylsíranu sodného R a 0,100 g modři bromfenolové R se rozpustí ve vodě R. Přidá se 50,0 ml glycerolu R a zředí se vodou R na 80 ml. Upraví se pH (2.2.3) kyselinou chlorovodíkovou R na hodnotu 6,8 a zředí se vodou R na 100 ml. Bezprostředně před použitím se přidá dithiothreitol R do konečné koncentrace 0, 250 mol/l.

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci bílkoviny 1 mg/ml. K 150 pl tohoto roztoku se přidá 38 pl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (a). Připraví se stejně jako zkoušený roztok, ale místo zkoušeného přípravku se použije interferon gama-1 b CRL.

Porovnávací roztok (b) (5 ng kontrola). 50 µl roztoku albuminu hovězího R (0, 01 mg/ml) se smíchá s 2000 pl vody R a 450 pl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (c) (2 ng kontrola). 20 pl roztoku albuminu hovězího R (0, 01 mglml) se smíchá s 2000 pl vody R a 450 pl roztoku pro vzorek.

Porovnávací roztok (d). Použije se roztok standardů molekulových hmotností vhodných pro kalibraci SDSpolyakrylamidových gelů v rozpětí 10 kDa do 70 kDa.

Každý roztok se ve zkumavce nechá 15 min při pokojové teplotě a pak se uchovává na ledu.

Do jamek zaostřovacího gelu se nanese po 25 íxl každého roztoku. Za podmínek doporučených výrobcem zařízení se provede elektroforéza a bílkoviny se detegují barvením stříbrem.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže splňuje validační kritéria (2.2.31); na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) a (c) je vždy vidět pás.

Hlavní pás na elektroforeogramu zkoušeného roztoku odpovídá intenzitou hlavnímu pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a). Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku není vidět žádný významný pás, který by nebyl přítomen na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) (0,01 %). Jako významný pás je definován jakýkoliv pás, jehož intenzita je stejná nebo větší než intenzita pásu na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (c).

Norleucin. Nejvýše 0,2 molu norleucinu na mol interferonu gama-lb; stanoví se analýzou aminokyselin.

Zkoušený roztok. 2,5 ml zkoušeného přípravku se nanese na kolonu vhodnou pro odsolení bílkovin, která byla předtím ustálena 25 ml roztoku kyseliny octové R 10 % (V/V). Vzorek se eluuje 2,5 ml roztoku kyseliny octové R 10 % (Y/i~. Stanoví se obsah bílkovin měřením absorbance tohoto roztoku, jak je popsáno v odstavci Stanovení bílkovin. Objem obsahující množství odpovídající 100 pg interferonu gama-lb se napipetuje do každé ze tH reakčních lahviček a odpaří se do sucha za sníženého tlaku.

Hydrolýza tří vzorků se provede takto: do každé reakční lahvičky se přidá 200 pl roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50 % (V/V) obsahující fenol R 1 % (V/V); vzorky se evakuují a vyčistí dusíkem, potom se hydrolyzují v plynné fázi. Lahvičky se 22 h zahřívají při 110 °C. Po hydrolýze se odpaří do sucha za sníženého tlaku.

Derivatizace vzorků se provede takto: bezprostředně před použitím se připraví směs objemových dílů ethanolu R, vody R a triethylaminu R (2 + 1 + 1). 50 pl tohoto roztoku se přidá do každé reakční lahvičky, lehce se protřepe a odpaří se za sníženého tlaku do sucha. Do každé lahvičky se přidá 50 pl směsi objemových dílů ethanolu R, vody R, triethylaminu R a fenylisothiokyanat R (7 + 1 + 1 + 1). Lehce se protřepe a nechá se stát asi 15 min při pokojové teplotě. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku a vzorky se rekonstituují v 250 ul mobilní fáze A.

Zásobní roztok norleucinu. Připraví se roztok Dt-norleucinu R (250 nmoUml) v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Tento roztok se může uchovávat 2 měsíce při 4 °C.

Zásobní roztok leucinu. Připraví se roztok leucinu R (250 nmoUml) v kyselině chlorovodíkové 0,01 mol/l RS. Tento roztok se může uchovávat 2 měsíce při 4 °C.

Porovnávací roztok. V každé ze tří reakčních lahviček se smíchá 10 μl zásobního roztoku norleucinu a 100 pl zásobního roztoku leucinu. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku a provede se derivatizace vzorku, jak je předepsáno pro přípravu zkoušeného roztoku.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 3,9 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (4 μm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1,0 ml/min,
  • mobilní fáze A - smíchají se objemové díly roztoku octanu sodného R (19 gn), který obsahuje triethylamin R 0,05 (V/V) a jehož pH bylo kyselinou octovou zředěnou RS upraveno na hodnotu 6,4, s objemovými díly mobilní fáze B (70 + 30),
  • mobilní fáze B - smíchají se objemové díly vody R a acetonitrilu R (40 + 60),
  
  

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámka
  0 - 7	100	0	izokraticky
  7 - 7,1	100 → 0	0 → 100	lineární gradient
  7,1 - 10	0	100	promývání
  10 - 10,1	0 → 100	100 → 0	lineární gradient
  10,1 - 15	100	0	znovuustalování

• spektrofotometrického detektoru, 254 nm.

Teplota kolony se udržuje při 43 °C.

Nastříkne se 50 pl ze všech roztoků.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku se identifikují piky odpovídající leucinu a norleucinu. Retenční čas norleucinu je 6,2 min až 7 min.

Vypočítá se obsah norleucinu (v molech norleucinu na mol interferonu gama-lb) z ploch píku leucinu a norleucinu na chromatogramech porovnávacího roztoku a zkoušeného roztoku za předpokladu, že na mol interferonu gama-lb připadá 10 molů leucinu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 5 m.j. endotoxinu v objemu obsahujícím 20.106 m.j. interferonu gama-lb.

Stanovení obsahu a účinnosti

Bílkovina (2.2.25). Zkoušený přípravek se zředí vodou R na koncentraci interferonu 1 mg/ml. Zaznamená se absorpční spektrum mezi 220 nm a 340 nm. Změří se hodnota absorbance v maximu při 280 nm, po korekci na rozptýlené světlo v důsledku zákalu změřené při 316 nm. Koncentrace interferonu gama-lb se vypočítá s použitím specifické absorbance, která má hodnotu 7,5.

Účinnost. Účinnost se stanoví vyhodnocením vzestupu exprese DR-antigenu lidských leukocytů (HLA-DR) způsobené interferonem gama-lb přítomným ve zkoušených roztocích při kultivaci buněk a srovnáním tohoto vzestupu se stejným účinkem vhodného mezinárodního standardu lidského rekombinantního interferonu gama nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Mezinárodní zdravotnická organizace.

Stanovení se provede vhodnou metodou, založenou na následujícím uspořádáni.

Použijí se buňky COLO 205 v podmínkách standardní kultury. Tří až pětidenní nárůst COLO 205 buněk v baňce se trypsinizuje a připraví se buněčná suspenze o koncentraci 1,0 .106 buněk v mililitru. Na mikrotitrační destičky o 96 jamkách se do každé jamky přidá 100 μl zředěného média. Do jamek určených pro slepou zkoušku se dá ještě jednou po 100 ul tohoto média. Na destičku se přidá po 100 µl od všech zkoušených roztoků a provede se řada dvojnásobných ředění, aby se získala standardní křivka. Pak se do všech jamek přidá po 100 pl buněčné suspenze a destička se inkubuje v podmínkách vhodných pro kultivaci buněk.

Po kultivaci se odstraní růstové médium a buňky se promyjí a fixují na destičku. Přidá se protilátka schopná detegovat HLA-DR exprimovaný v důsledku přítomnosti interferonu gama-lb a inkubuje se ve vhodných podmínkách. Po promytí destičky se provede inkubace s protilátkou konjugovanou se značeným enzymem, která je schopná detegovat anti-HLA-DR protilátku. Po tomto inkubačním kroku se destička opláchne a přidá se roztok vhodného substrátu. Reakce se zastaví, měří se absorbance roztoku a obvyklými statistickými metodami se vypočítá účinnost zkoušeného přípravku.

Zjištěná specifická účinnost je 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) zjištěné účinnosti je v rozmezí 70 % až 140 %.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, chráněn před světlem a při teplotě -70 °C.

Separandum.