Omega-3 acidorum triglycerida

2001

Triacylglyceroly omega-3-kyselin

Je to směs mono-, di- a triesterů omega-3-kyselin s glycerolem obsahující převážně triestery. Získávají se bud' esterifikací koncentrovaných a čištěných omega-3-kyselin s glycerolem, nebo transesterifikací ethylesterů omega-3-kyselin s glycerolem. Zdrojem omega-3-kyselin je olej získaný z těl tučných ryb, druhů patřících k čeledím jako jsou Engraulidae, Carangidae, Clupeidae, Osmeridae, Salmonidae a Scrombroidae. Jako omega-3-kyseliny se označují následující kyseliny: kyselina alfa-linolenová (C18:3 n-3), kyselina moroktová (C18:4 n-3), kyselina ikosatetraenová (C20:4 n-3), kyselina timnodonová (ikosapentaenová) (C20:5 n-3; EPA), kyselina henikosapentaenová (C21:5 n-3), kyselina klupanodonová (C22:5 n-3) a kyselina cervonová (dokosahexaenová) (C22:6 n-3; DHA). Koncentrace celkového množství omega-3-kyselin, vyjádřených jako triacylglyceroly, je nejméně 60,0 %. Součet koncentrací omega-3-kyselin EPA a DHA, vyjádřených jako triacylglyceroly, je nejméně 45,0 %.

Jako antioxidační přísada se může přidat tokoferol.

Vlastnosti

Světle žlutá kapalina, prakticky nerozpustná ve vodě, velmi snadno rozpustná v acetonu a v heptanu, těžce rozpustná v ethanolu.

Zkouška totožnosti

Hodnotí se chromatogramy získané při stanovení obsahu EPA a DHA. Retenční čas a velikost píků odpovídajících methylesteru kyseliny ikosapentaenové a methylesteru kyseliny dokosahexaenové na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) přibližně odpovídají retenčnímu času a velikostí píků na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).

Zkoušky na čistotu

Číslo anisidinové. Nejvýše 30,0.

Číslo anisidinové je definováno jako 100násobek absorbance roztoku obsahujícího 1 g zkoušené látky ve 100 ml směsi rozpouštědel a zkoumadel, měřené v 1 cm kyvetě podle dále popsané metody.

Zkouška se provádí co nejrychleji za ochrany před aktinickým světlem.

Zkoušený roztok (a). 1,0 g se rozpustí v trimethylpentanu R a zředí se jím na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). K 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové R, protřepe se a clu-ání před světlem.

Porovnávací roztok. K 5,0 ml trimethylpentanu R se přidá 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové R, protřepe se a chrání před světlem.

Měří se Absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku (a) při 350 nm za použití trimethylpentanu R jako kontrolní kapaliny. Měří se absorbance zkoušeného roztoku (b) při 350 nm přesně 10 min po jeho přípravě s použitím porovnávacího roztoku jako kontrolní kapaliny.

Číslo anisidinové se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

A_s - absorbance zkoušeného roztoku (b),
A_b - absorbance zkoušeného roztoku (a),
m - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku (a) v gramech.

Číslo peroxidové (2.2.5, Metoda A).Nejvýše 10,0.

Oligomery a parciální acylglyceroly. Nejvýše 3,0 % oligomerů a nejvýše 50,0 % parciálních acylglycerolů. Provede se vylučovací chromatogratie (2.2.30).

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí v tetrahydrofuranu R a zředí se jím na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• kolony délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné styrendivinylbenzen-kopolymerem R (velikost pórů 10 nm, velikost částic 7 Itm) a dvou kolon délky 0,3 m a vnitřního průměru 7,8 nun naplněných styrendivinylbenzen-kopolymerem R (velikost pórů 50 nm, velikost částic 7 pm) (tyto kolony se umístí co nejblíže k dávkovači),
• tetrahydrofuran R jako mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,8 ml/min,
• diferenčního refraktometru jako detektoru.

Nastříkne se 40 µl zkoušeného roztoku. Jednotlivé píky se určí podle vzorového chromatogramu (obr. 1). Obsah oligomerů v procentech se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

A - součet ploch všech píků na chromatogramu,
B - plochu píku s retenčním časem menším, než je retenční čas píku triacylglycerolu.

Obsah parciálních acylglycerolů v procentech se vypočítá podle vztahu:

v němž značí:

C - plochu (součet ploch) píku(ů) mono- a diacylglycerolů.

Konjugované dieny. Nejvýše 2,7 %;provede se absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25). Celý postup se provádí co možná nejrychleji.

Zkoušený roztok: 0,200 g až 0,800 g se rozpustí v trimethylpentanu RI a zředí se jím na 50,0 ml.

Měří se absorbance při 233 nm. V případě potřeby se koncentrace roztoku upraví tak, aby hodnota absorbance byla 0,2 až 0,8. Obsah konjugovaných dienů v procentech se vypočítá podle vztahu:

0,91 ·		A	- 0,07		,
		C

v němž značí:

A - absorbance zkoušeného roztoku,
c - koncentrace zkoušeného roztoku v g/l,
0,91 - konverzní faktor,
0,07 - korekční faktor pro absorbanci esterových skupin při 233 nm.

Stanovení obsahu

EPA a DHA. Celý postup se provádí co možná nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem, oxidačními činidly, oxidačními katalyzátory (např. měď a železo) a vzduchem.

Provede se plynová chromatografie (2.2.28). Ve zkoušené látce se stanoví methylestery kyselin all-cis-ikosa5,8, 11,14,17-pentaenové (EPA; 20:5 n-3) a all-cis-dokosa-4,7, 10,13,16,19-hexaenové (DHA; 22:6 n-3).

Vnitřní standard. Methyltrikosanoat R.

Zkoušený roztok (a). 0,300 g zkoušené látky a asi 70,0 mg vnitřního standardu se rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 g/l) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml. 2,0 ml získaného roztoku se převede do křemenné zkumavky a rozpouštědlo se odpaří mírným proudem dusíku R. Přidá se 1,5 ml roztoku hydroxidu draselného R (20 g/l) v methanolu R, převrství se dusíkem R, dobře se uzavře uzávěrem potaženým polytetrafluorethylenem, zamíchá se a zahřívá se 7 min na vodní lázni. Po vychladnutí se přidají 2 ml chloridu boritého v methanolu RS, převrství se dusíkem R, dobře se uzavře, promíchá a zahřívá se 30 min na vodní lázni. Po ochlazení na 40 °C až 50 °C se přidá 1 ml trimethylpentanu R, uzavře se a důkladně nejméně 30 s se třepe. Bezprostředně poté se přidá 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného R, převrství se dusíkem R, uzavře se a důkladně se 15 s třepe. Horní vrstva se přemístí do samostatné zkumavky. Methanolová vrstva se třepe ještě jednou s 1 ml trimethylpentanu R. Spojené trimethylpentanové extrakty se ještě dvakrát promyjí 1 ml vody R a suší se nad sáranem sodným bezvodým R. Připraví se dva roztoky pro každý vzorek.

Zkoušený roztok (b). 0,300 g se rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 g/l) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml. Dále se pokračuje, jak je předepsáno pro Zkoušený roztok (a).

Porovnávací roztok (a). 60,0 mg ethyldokosahexaenoatu CRL, asi 70,0 mg vnitřtrního standardu a 90,0 mg ethylikosapentaenoatu CRL se rozpustí v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 gn) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml. Dále se pokračuje, jak je předepsáno pro Zkoušený roztok (a).

Porovnávací roztok (b).0,3 g methylpalmitatu R, 0,3 g methylstearatu R, 0,3 g methylarachidatu R a 0,3 g methylbehenatu R se převede do 10ml odměrné baňky, rozpustí se v roztoku butylhydroxytoluenu R (0,05 g/I) v trimethylpentanu R a zředí se stejným roztokem na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• křemenné kapilární kolony délky nejméně 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm s vnitřní stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R (tloušťka filmuje 0,25 pm),
• vodíku pro chromatografie R nebo helia pro chromatografie R jako nosného plynu s použitím deoxo filtru,
• plamenoionizačního detektoru,
• injektorové smyčky (1 : 200).

Teplota kolony se 0,5 min udržuje na 170 °C, pak se zvyšuje rychlostí 10 °C/min na 240 °C a udržuje se 22 min na 240 °C; teplota vstřikovacího prostoru je 250 °C a teplota detektoru je 280 °C.

Nastříkne se dvakrát po 1 µl každého roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) jsou tři píky odpovídající methylikosapentaenoatu, methyltrikosanoatu a methyldokosahexaenoatu,
• na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) stoupá procentuální plošné zastoupení v následujícím pořadí: methylpalmitat, methylstearat, methylarachidat, methylbehenat; rozdíl mezi procentuálním plošným zastoupením methylpalmitatu a methylbehenatu je menší než dvě plošná procenta,
• při korekci na vnitřní standard je výtěžnost stanovení provedených metodou standardního přídavku ke zkoušenému roztoku (a) větší než 95 % přidaného množství ethyldokosahexaenoatu CRL a ethylikosapentaenoatu CRL.

Obsah EPA a DHA, vyjádřených jako triacylglyceroly, se vypočítá v procentech podle následujícího vztahu (do výpočtu se zahrnuje vyznačená hodnota pro porovnávací látky):

v němž značí:

(A₂ . C) je korekční faktor pro pík eluovaný společně s vnitřním standardem:

Celkový obsah omega-3-kyselin. Celkový obsah omega-3-kyselin vyjádřený jako triacylglyceroly se v procentech vypočítá podle vztahu, v němž se použijí hodnoty získané při stanovení EPA a DHA a jednotlivé píky se určí ze vzorových chromatogramů (obr. 2 a obr. 3):

v němž značí:

Uchovávání

Ve vzduchotěsných zcela naplněných obalech, chráněny před světlem, v inertní atmosféře.

Označování

V označení na obalu se uvede koncentrace přidaného tokoferolu.

Obr. 1 Vzorový chromatogram pro oligomery a parciální acylglyceroly

O = oligomer, T = triacylglyceroly, D = diacylglyceroly, M = monoacylglyceroly

Obr. 2 Vzorový chromatogram pro stanovení celkového obsahu omega-3-kyselin

Obr. 3 Vzorový chromatogram pro stanovení celkového obsahu omega-3-kyselin