Somatropini solutio ad praeparationem

R99

Koncentrovaný roztok somatropinu

Je to roztok obsahující bílkovinu se strukturou (191 aminokyselinových zbytků) hlavní složky růstového hormonu produkovaného lidskou hypofýzou. Může obsahovat tlumivé soli a jiné pomocné
látky. Obsahuje 91,0 % až 105,0 % deklarovaného obsahu somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇). Vyho
vuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

1 mg bezvodého somatropinu (C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇) odpovídá 3,0 m.j. biologické účinnosti.

Výroba

Připravuje se metodou založenou na rekombinaci DNK (rDNK). Při vývoji přípravku se prokáže vhodnou validovanou metodou stanovení biologické účinnosti, založenou na stimulaci růstu a schválenou oprávněnou autoritou, že výrobní postup dává látku, jejíž biologická účinnost je nejméně 2,5 m.j. v miligramu.

Zkoušený roztok vyhovuje následujícím dodatečným požadavkům.

Bilkoviny hostitelské buňky. Požadavek schválí oprávněná autorita.

DNK hostitelské buňky a vektoru. Požadavek schválí oprávněná autorita.

Vlastnosti

Čirý nebo slabě opalizující, bezbarvý roztok.

Zkoušky totožnosti

1. Hodnotí se elektroforeogramy ze zkoušky Distribuce izoforem, viz Zkoušky na čistotu. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) odpovídá hlavní zóna polohou hlavní zóně na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a).
2. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Příbuzné bílkoviny, viz Zkoušky na čistotu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.
3. Provede se peptidové mapování.

   Zkoušený roztok. Zkoušený roztok se zředí tlumivým roztokem trometamolovým o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby obsahoval 2,0 mg somatropinu v mililitru. Asi 1,0 ml takto připraveného roztoku se převede do zkumavky z vhodného materiálu, např. polypropylenu, a přidá se 30 µl čerstvě připraveného roztoku trypsinu pro peptidové mapování R (1 mg/ml) v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l). Zkumavka se uzavře a vloží se na 4 h do vodní lázně 37 °C teplé. Potom se zkumavka vyjme z vodní lázně a ihned se probíhající reakce přeruší, např. zmrazením. Je-li okamžitě použit automatický dávkovač, udržuje se teplota na 2 °C až 8 °C.

   Poznámka. Stejný vzájemný poměr (mikrogram trypsinu na miligram somatropinu) se použije, jestliže nelze získat koncentrace 2 mg somatropinu v mililitru.

   Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) a zpracuje se současně stejným způsobem jako zkoušený roztok.

   Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   • nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm až 10 µm),
   • mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
   • mobilní fáze A - 1 ml kyseliny trifluoroctové R se zředí vodou R na 1000 ml,
   • mobilní fáze B - ke 100 ml vody R se přidá 1 ml kyseliny trifluoroctové R a zředí se acetonitrilem pro chromatografii R na 1000 ml,
   • následujícího gradientu (je-li třeba, gradient nebo teplota kolony se nastaví tak, aby se dosáhlo požadovaného rozdělení produktů enzymatického štěpení):
   
   

   Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)
   0 - 20	100 → 80	0 → 20
   20 - 40	80 → 75	20 → 25
   40 - 65	75 → 50	25 → 50
   65 - 70	50 → 20	50 → 80
   70 - 71	20 → 100	80 → 0
   71 - 85	100	0

   
   
   • spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

   Teplota kolony se udržuje na 30 °C.

   Kolona se nejméně 15 min ustaluje mobilní fází A. Provede se slepá zkouška za použití výše uvedeného gradientu.

   Nastříkne se 100 µl zkoušeného roztoku a 100 µl porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže chromatogramy obou roztoků kvalitativně odpovídají referenčnímu chromatogramu Ph. Eur. enzymaticky štěpeného somatropinu. Chromatografický profil zkoušeného roztoku odpovídá chromatogramu porovnávacího roztoku.

4. Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Příbuzné bílkoviny. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného výrobku v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu nebo méně, potom se podle toho upraví objem injekce.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Roztok pro rozlišení (validační směs somatropinu a desamidosomatropinu). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,5 (0,05 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg. Zfiltruje se přes sterilní filtr nebo se přidá azid sodný R do koncentrace 0,1 mg v mililitru roztoku a nechá se 24 h stát při pokojové teplotě.

Roztoky se uchovávají při teplotě 2 °C až 8 °C a použijí se do 24 h. Pokud se používá automatický dávkovač, je nutno jej udržovat při 2 °C až 8 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem butylsilanizovaným pro chromatografci R (velikost částic 5 µm a velikost pórů 30 nm), která je umístěna mezi pumpu a nástřikový ventil,
• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů propanolu R a tlumivého roztoku trometamolového o pH 7,5 (0,05 mol/l) (29 + 71); průtoková rychlost je 0,5 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Teplota kolony se udržuje při 45 °C.

Před použitím se kolona promývá 200 ml až 500 ml 0,1% (V/V) roztokem kyseliny trifluoroctové R v 50% (V/V) acetonitrilu R. Je-li třeba, promývání se opakuje do ustálení kolony.

Nastříkne se 20 µl porovnávacího roztoku. Je-li třeba, upraví se koncentrace propanolu R v mobilní fázi tak, aby retenční čas hlavního píku byl asi 33 min.

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Na chromatogramu se objeví malý pík (desamidosomatropin) s relativním retenčním časem k hlavnímu píku asi 0,85. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi píky somatropinu a desamidosomatropinu je nejméně 1,0 a hodnota faktoru symetrie píku somatropinu je 0,9 až 1,8.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 6,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píkům rozpouštědel.

Dimer a příbuzné látky s vyšší molekulovou hmotností. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30), jak je popsána ve zkoušce Stanovení obsahu.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku. Na chromatogramu zkoušeného roztoku součet ploch píků s retenčním časem kratším, než je retenční čas hlavního píku, není větší než 4,0 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píkům rozpouštědel.

Distribuce izoforem. Provede se izoelektrická fokusace.

Zkoušený roztok (a). Zkoušený roztok se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 moUl) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Zkoušený roztok (b). K 0,1 ml zkoušeného roztoku (a) se přidá 1,9 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,025 mol/l).

Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok somatropinu CRL v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 2,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok (b). Použije se roztok pro kalibraci izoelektrického bodu o rozmezí pH 2,5 až 6,5, připravený podle návodu výrobce.

Se zařízením se pracuje podle návodu výrobce. Izoelektrická fokusace se provádí na hotových deskách s vrstvou gelu o rozměrech 245 mm x 110 mm x 1 mm a pH v rozmezí 4,0 až 6,5. Na vrstvu gelu se nanese odděleně po 15 µl každého roztoku. Jako anodický roztok se použije roztok kyseliny glutamové R (14,7 g/l) v roztoku kyseliny fosforečné R (50 g H₃P0₄/l) a jako katodický roztok se použije roztok β-alaninu R (89,1 g/l). Pracovní podmínky se nastaví na 2000 V a 25 mA. Fokusace se nechá probíhat 2,5 h při konstantním napětí a výkonu nepřevyšujícím 25 W. Potom se vrstva gelu ponoří na 30 min do roztoku obsahujícího kyselinu trichloroctovou R (115g/l) a kyselinu sulfosalicylovou R (34,5 g/l) a pak na 5 min do směsi objemových dílů kyseliny octové R, ethanolu R a deionizované vody R (8 + 25 + 67) (odbarvovací roztok). Vrstva gelu se zbarví ponořením na 10 min do 60 °C teplého roztoku modři kyselé 83 R (1,15 g/l) v odbarvovacím roztoku a potom se ponoří do odbarvovacího roztoku do odstranění nadbytku barviva.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozdělení zón na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (b) odpovídá pokynům výrobce. Na elektroforeogramu porovnávacího roztoku (a) je viditelná hlavní zóna s izoelektrickým bodem při asi 5 a kyselejší menší zóna při asi 4,8. Na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (a) žádná zóna, kromě hlavní zóny, nepřevyšuje svou intenzitou hlavní zónu na elektroforeogramu zkoušeného roztoku (b) (5 %).

Sterilita (2.6.1). Pokud je přípravek určen k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li v miligramu nejvýše 5 m.j. endotoxinu

Stanovení obsahu

Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného roztoku v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,0 (0,025 mol/l) tak, aby v mililitru obsahoval 1,0 mg somatropinu.

Porovnávací roztok. Obsah lahvičky somatropinu CRL se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 mol/l) na koncentraci 1,0 mg/ml.

Roztok pro rozlišení. Lahvička somatropinu CRL se nechá v sušárně při 50 °C po dobu (obvykle 12 h až 24 h) dostačující k vytvoření 1 % až 5 % dimeru. Obsah lahvičky se zředí tlumivým roztokem fosforečnanovým o pH 7,0 (0,025 mol/l) na koncentraci 1,0 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,30 m a vnitřního průměru 7,8 mm naplněné silikagelem hydrofilním pro chromatograf i R jakosti vhodné pro dělení globulárních bílkovin v rozmezí molekulové hmotnosti 5000 až 150 000,
• mobilní fáze, kterou je zfiltrovaná a odplyněná směs objemových dílů 2-propanolu R a tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,0 (0,063 mol/l) (3 + 97); průtoková rychlost je 0,6 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 214 nm.

Nastříkne se 20 µl roztoku pro rozlišení. Na získaném chromatogramu je retenční čas hlavního píku asi 12 min až 17 min a relativní retenční časy dimeru somatropinu a proteinů s vyšší molekulovou hmotností jsou 0,90 a 0,65, vztaženo k hlavnímu píku. Rozlišení dané poměrem výšky minima nad základní linií mezi píky monomeru a dimeru k výšce píku dimeru je nejvýše 0,4.

Nastřikuje se 20 µl zkoušeného roztoku a 20 µl porovnávacího roztoku.

Obsah somatropinu se vypočítá z ploch pílců na chromatogramu zkoušeného roztoku a na chromatogramu porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu látky C₉₉₀H₁₅₂₈N₂₆₂O₃₀₀S₇ v somatropinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech, při teplotě -20 °C. Je třeba vyhnout se opakovanému zmrazení a rozmrazení roztoku. Je-li roztok sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah somatropinu v miligramech v mililitru roztoku,
• název a množství jakýchkoliv pomocných látek,
• zda je roztok sterilní,
• zda je roztok prostý bakteriálních endotoxinů.