Streptokinasum

Streptokinasa

Je to bílkovinný přípravek získaný z filtrátů kultury určitých kmenů hemolytických streptokoků skupiny C. Má schopnost se spojit s lidským plazminogenem a vytvořit aktivátor plazminogenu. Látka je vyčištěná tak, aby před přidáním stabilizátoru nebo nosiče byla streptokinasová účinnost nejméně 600 m.j. na mikrogram dusíku. Obvykle obsahuje tlumivý roztok a může být stabilizována přídavkem vhodných látek, jako je lidský albumin.

Vlastnosti

Bílý prášek nebo bílá drobívá tuhá látka, hygroskopická. Je snadno rozpustná ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. Do hemolyzační zkumavky umístěné ve vodní lázni při 37 °C se převede 0,5 ml citrátové lidské, psí nebo králičí plazmy, přidá se 0,1 ml roztoku zkoušené látky v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,2 obsahujícího 10 000 m.j. streptokinasové účinnosti v mililitru a 0,1 ml roztoku trombinu lidského R v tlumivém roztoku fosforečnanovém o pH 7,2 obsahujícího 20 m.j. v mililitru a ihned se protřepe. Vytvoří se sraženina, která se rozpustí v průběhu 30 min. Celý postup je nutné opakovat při použití hovězí citrátové plazmy. V průběhu 60 min se vznildá sraženina nerozpustí.
2. 0,6 g agaru se rozpustí v 50,0 ml tlumivého roztoku barbitalového o pH 8,6 (1) a zahřívá se, pokud není roztok čirý. Připraví se skleněné destičky o ploše 50 x 50 mm upevněné tak, aby byly průhledné, a zbaví se stop mastnoty. Na každou destičku se napipetují 4 ml roztoku agaru (viz níže) a ponechají se v horizontální poloze ochladit. Ve středu agaru se vyřízne jamka o průměru 6 mm a dostatečný počet jamek (nepřesahující 6) se vyřízne ve vzdálenosti 11 mm od střední jamky. Zbylý agar se z jamek odsaje hadičkou napojenou na vakuovou pumpu. Mikropipetou se do střední jamky napipetuje 80 µl kozího nebo králičího antistreptokinasového séra obsahujícího 10 000 jednotek antistreptokinasové účinnosti v mililitru. Do okolních jamek se napipetuje 80 µl roztoku zkoušené látky obsahující 125 000 m.j. streptokinasové účinnosti v mililitru. Destičky se umístí na 24 h do vlhké komory. Vytvoří se pouze jeden dobře zřetelný precipitační oblouk umístěný mezi jamkou se sérem a každou jamkou s roztokem zkoušené látky.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,8 až 7,5; měří se roztok zkoušené látky ve vodě prosté oxidu uhličitého R obsahující 5000 m.j. streptokinasové účinnosti v mililitru.

Zkoušený roztok. Zkoušená látka se rozpustí v tlumivém roztoku imidazolovém o pH 6, S v takovém množství, aby roztok obsahoval 150 000 m.j. streptokinasové účinnosti v mililitru.

Porovnávací roztok. Porovnávací přípravek streptodornasy kalibrovaný v mezinárodních jednotkách na mezinárodní standard streptodornasy se rozpustí v tlumivém roztoku imidazolovém o pH 6,5 v takovém množství, aby roztok obsahoval 20 m.j. streptodornasové účinnosti v mililitru. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Do každé z osmi očíslovaných centriµgačních zkumavek se převede 0,5 ml roztoku kyseliny deoxyribonukleové sodné soli R (1 g/l) v tlumivém roztoku imidazolovém o pH 6,5. Do zkumavek č. 1 a č. 2 se přidá 0,25 ml tlumivého roztoku imidazolového o pH 6, S, 0,25 ml zkoušeného roztoku a ihned se přidají 3,0 ml kyseliny chloristé R ( 25 g HC104/1). Po promíchání se směs odstřed'uje 5 min při 3000 g/l a měří se Absorbance (2.2.25) supernatantní tekutiny při 260 nm proti kontrolnímu roztoku, kterým j e směs 1,0 ml tlumivého roztoku imidazolového o pH 6, S a 3,0 ml roztoku kyseliny chloristé R ( 25 g HC104 /1) (absorbance A, a AZ). Do dalších šesti zkumavek (čísla 3 až 8) se převede 0,25 ml, 0,25 ml, 0,125 ml, 0,125 ml, 0 ml a 0 ml tlumivého roztoku imidazolového 0 pH 6, S. Do každé zkumavky se přidá 0,25 ml zkoušeného roztoku a 0 ml, 0 ml, 0,125 ml, 0,125 ml, 0,25 ml a 0,25 ml porovnávacího roztoku. Každá zkumavka se promíchá a zahřívá 15 min při 37 °C. Pak se do každé zkumavky přidají 3,0 ml kyseliny chloristé R (25 g HClO4/l), promíchá se a odstřed'uje se. Měří se Absorbance (2.2.25) supernatantních tekutin při 260 nm proti výše uvedenému kontrolnímu roztoku (absorbance A3 až Ag):

(ekvivalent k maximu 10 m.j. streptodornasové účinnosti na 100 000 m.j. streptokinasové účinnosti).

Streptolysin. V hemolyzační zkumavce se rozpustí takové množství zkoušeného přípravku, aby v 0,5 ml směsi objemových dílů tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,2 a roztoku chloridu sodného R (9 g/l) (1 + 9) bylo 500 000 m.j. streptol~inasové účinnosti. Pak se přidá 0,4 ml roztoku thioglykolanu sodného R (23 gn) a směs se zahřívá 10 min ve vodní lázni při 37 °C. Přidá se 0,1 ml porovnávacího roztoku lidského antistreptolysinu O obsahujícího 5 m.j. v mililitru. Po 5 min zahřívání při 37 °C se přidá 1 ml erytrocytů králičích suspenze R, zahřívá se 30 min při 37 °C a odstřed'uje se při 1000 g„. Stejným způsobem se připraví hemolyzační zkumavka, ve které je místo roztoku zkoušeného přípravku 0,5 ml směsi objemových dílů tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,2 a roztoku chloridu sodného R (9 g/l) (1 + 9). Měří se Absorbance (2.2.25) supernatantních tekutin při 550 nm. Absorbance zkoušeného roztoku je nejvýše o 50 % vyšší než absorbance porovnávacího roztoku.

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 4,0 %; suší se 24 h nad oxidem fosforečným R a při tlaku nepřevyšujícím 2,7 Pa.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Neškodnost (2.6.9). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků, vyhovuje zkoušce na neškodnost, při níž se během 15 s až 20 s každé myši vstříkne množství přípravku odpovídající 50 000 m.j. streptokinasové účinnosti, rozpuštěné v 0,5 ml vody na injekci R.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním schopnosti aktivovat přeměnu plazminogenu na plazmin se schopností referenčního přípravku streptokinasy kalibrovaného v mezinárodních jednotkách; tvorba plazminu se měří stanovením doby rozpuštění fibrinové sraženiny za daných podmínek.

Mezinárodní jednotka je streptokinasová účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu, kterým je lyofilizovaná streptokinasa s laktosou. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Jestliže není předepsáno jinak, používá se pro přípravu roztoků a ředění při stanovení účinnosti tlumivý roztokfosforečnanový o pH 7,2 obsahující albumin hovězí R (30 g/l).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušeného přípravku s přepokládaným obsahem 1000 m.j . streptokinasové účinnosti v mililitru.

Porovnávací roztok. Připraví se roztok referenčního přípravku látky obsahující 1000 m.j . streptokinasové účinnosti v mililitru.

Zkoušený roztok a porovnávací roztok se uchovávají ve vodě s ledem a použijí se do 6 h.

Připraví se tři ředění (1, Snásobné) porovnávacího přípravku tak, aby nejdelší doba rozpuštění sraženiny byla menší než 20 min. Podobná ředění se připraví se zkoušeným roztokem.

Tyto roztoky se uchovávají ve vodě s ledem a použijí se do 1 h.

Připraví se 24 zkumavek o průměru 8 mm. Zkumavky se označí T1, T2 a T3 pro ředění zkoušeného roztoku a S1, S2 a S3 pro ředění porovnávacího roztoku. Pro každé ředění se použijí čtyři. Všechny zkumavky se umístí do vody s ledem a do každé se převede 0,2 ml příslušného ředění, 0,2 ml tlumivého roztoku fosforečnanového o pH 7,2 obsahujícího albumin hovězí R (30 g/l) a 0,1 ml roztoku trombinu lidského R obsahujícího 20 m.j. v mililitru. Zkumavky se přemístí do vodní lázně při 37 °C a nechají se 2 min temperovat. Automatickou pipetou se na dno první zkumavky převede 0,5 ml roztoku euglobulinů lidských R (10 g/l) a důkladně se promíchá. V intervalech 5 s se přidává 0,5 ml roztoku euglobulinů lidských R (10 g/l) do dalších zkumavek. Na stopkách se měří u každé zkumavky časový interval v sekundách mezi přidáním euglobulinů a rozpuštěním sraženiny.

Změřené časové intervaly se převedou na 10garitmy a pomocí obvyklých statistických metod s e vypočítá účinnost zkoušené látky v porovnání s účinností referenčního přípravku.

Stanovená účinnost je 90 % až 111 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) stanovení účinnosti je 80 % až 125 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněna před světlem. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet mezinárodních jednotek streptokinasové účinnosti v miligramu, počítáno na vysušenou látku,
• název a množství každé přidané látky,  
• zda je látka sterilní,
• zda je látka prostá pyrogenních látek,
• zda je látka vhodná pro výrobu parenterálních přípravků.