Urofollitropinum

Urofollitropin

Je to suchý přípravek obsahující menopauzální gonadotropin získaný z moči postmenopauzálních žen. Má folikulostimulující účinek a žádnou nebo téměř žádnou luteinizační účinnost. Účinnost je nejméně 90 m.j. folikulostimulujícího hormonu (hFSH) v miligramu. Poměr jednotek luteinizačního hormonu (hLH) (hormonu stimulujícího intersticiální buňky - ICSH) k jednotkám folil~ulostimulujícího hormonu je nejvýše 1/60.

Výroba

Připravuje se vhodným frakcionačním postupem s následnou imunoafmitní chromatografií za podmínek, které snižují na nejnižší míru mikrobiální kontaminaci. Výrobní postup prokazatelně omezuje jakoukoliv kontaminaci viry, jako je virus hepatitidy nebo HIV, vhodnými validovanými metodami.

Vlastnosti

Téměř bílý nebo slabě nažloutlý prášek. Je rozpustný ve vodě.

Zkouška totožnosti

Podá-li se infantilním samicím potkana, jak je předepsáno v odstavci Stanovení účinnosti, vyvolá zvýšení hmotnosti vaječníků.

Zkoušky na čistotu

Antigeny virové hepatitidy. Při vyšetření vhodně citlivou imunochemickou metodou (2. 7.1) se nezjistí antigeny virové hepatitidy.

Antigen H1V. Při vyšetření vhodně citlivou imunochemickou metodou (2. 7.1) se nezjistí antigen HIV.

Reziduální luteinizační účinnost. Mezinárodní jednotka FSH a LH j sou účinnosti obsažené v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského močového folikulostimulujícího hormonu a luteinizačního hormonu (tj. hormonu stimulujícího intersticiální buňky), který sestává ze směsi extraktu z moči postmenopauzálních žen a laktosy. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace. Ke zkoušce se vyberou nedospělé samice potkana ve stári přibližně 21 ďní, u nichž rozdíl hmotnosti mezi největším a nejmenším zvířetem je nejvýše 10 g. Zvířata se náhodně rozdělí do čtyř stejných skupin po nejméně šesti jeáincích. Jsou-li dosažitelné čtyři samice z jednoho vrhu, rozdělí se po jeáné do každé skupiny a označí se.

V předběžné zkoušce se zvolí tři vhoďné dávky referenční látky tak, aby nejnižší dávka vyvolala snížení obsahu kyseliny askorbové ve vaječnících všech zvířat a nejvyšší dávka submaximální odpověď u všech zvířat. Použijí se dávky v geometrické řadě a jako první pokus se doporučují dávky 0,5 m.j., 1,0 m.j. a 2,0 m.j., avšak konečné dávkování závisí na citlivosti zvířat. Zvolí se dávka zkoušeného přípravku s předpoldadem, že obsahuje 60Xm.j. folikulostimulujícího hormonu (hFSH), kde X=počet m.j. hLH obsažených v prostřední z trojice dávek referenční látky. Referenční látka i zkoušený přípravek se rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnano-albuminovém o pH 7,2 tak, aby zvolené dávky referenční látky i zkoušeného přípravku byly obsaženy v objemu 1,0 ml.

Pro vlastní zkoušku se celý soubor zvířat připraví tím, že se všem infantilním samicím vstříkne podkožně první den 50 m.j. gonadotropinu séra R a čtvrtý den 25 m.j. gonadotropinu choriového R (oba v 0,5 ml tlumivého roztoku fosforečnano-albuminového o pH 7,2). Desátý den se třem skupinám infantilních samic vstříkne do ocasní žíly referenční látka (každé skupině jiná dávka) a čtvrté skupině dávka zkoušeného přípravku. Přesně za 4 h poté se zvířata usmrtí. U každé samice se vypreparují oba vaječníky, očistí od cizí tekutiny a tkáně a ihned se zváží. Oba vaječníky od každého zvířete zvlášť se zpracují takto: vaječníky se rozdrtí a 2 min se homogenizují v čerstvě připraveném roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l) při 4 °C a homogenát se týmž roztokem zřeďí na 7 ml. Nechá se 30 min stát při 4 °C a odstředí se pri 2500 g. Je-li třeba, supernatantní tekutina se zfiltruje 0,22µm filtrem.

Pripraví se čerstvý roztok sestávající ze směsi 2 ml roztoku octanu sodného R (45,3 gn), jehož pH bylo upraveno pridáním kyseliny octové R na 7,3 ml vody R a 2 ml standardizovaného 2,6-dichlorfenolindofenolu RS. Smíchají se 2 ml tohoto roztoku se 2 ml čiré supernatantní tekutiny. Za 30 s po smíchání se měří Absorbance (2.2.25) v maximu při asi 520 nm.

Množství kyseliny askorbové se odečte z kalibrační křivky, která se sestrojí stejným postupem z vhodných koncentrací kyseliny askorbové CRL rozpuštěné v roztoku kyseliny metafosforečné R (25 g/l). Výsledky se vyjádří jako obsah kyseliny askorbové v mg na 0,1 g hmotnosti vaječníků pro každou samici.

Stanoví se průměr obsahu kyseliny askorbové ve vaječnících samic po dávce zkoušeného přípravku a jeho odchylka. Pro každou skupinu dávek referenční látky se nanese průměrný obsah kyseliny askorbové ve vaječnících jako funkce 10garitmu dávky a za použití standardních analytických metod (metoda nejmenších čtverců) se zjišťuje úbytek obsahu kyseliny askorbové na 10garitmu podané dávky. Zkoušku lze hodnotit pouze v případě, jestliže:

• stálý sklon b je významný na 5% hladině významnosti,
• pro skupiny ošetřené referenční látkou se součet čtverců vzhledem k lineární regresi rovná 95 celkového součtu čtverců obsahu kyseliny askorbové,
• vnitroskupinový rozptyl obsahu kyseliny askorbové ve skupině ošetřené zkoušeným přípravkem se významně neliší na 5% hladině významnosti od vnitroskupinového rozptylu obsahu kyseliny askorbové ve skupinách ošetřených referenční látkou.

Průměr obsahu kyseliny askorbové ve vaječnících potkanů ošetřených zkoušeným přípravkem není významně nižší než průměr obsahu kyseliny askorbové ve vaječnících potkanů ošetřených střední dávkou referenční látky (počítáno z regresní rovnice) na 5% hladině významnosti.

Voda. Nejvýše 5,0 %;stanoví se plynovou chromatografií (2.2.28) za použití methanolu bezvodého R jako vnitřního standardu. Použije se suché sklo (může být silikonované).

Roztok vnitřního standardu. 15 µ methanolu bezvodého R se zředí 2 propanolem RI na 100 ml. Zkoušený roztok (a). 4 mg se rozpustí v 0,5 ml 2 propanolu Rl.

Zkoušený roztok (b). 4 mg se rozpustí v 0,5 ml roztoku vnitřního standardu. Porovnávací roztok. 10 µl vody R se přidá k 50 ml roztoku vnitřního standardu.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové kolony délky 1 m a vnitřního průměru 2 mm naplněné styrendivinylbenzen kopolymerem R (180 µm až 250 µm),
• helia pro chromatografii R jako nosného plynu,  
• teplotně vodivostního detektoru.

Teplota kolony je 120 °C a detektoru 150 °C.

Nastříknou se zvolené objemy všech roztoků. Vypočítá se obsah vody za předpokladu, že jej í hustota (2.2.5) při 20 °C je 0,9972 g/ml, přičemž se bere v úvahu voda zjistitelná v roztoku vnitřního standardu.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhoďného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Účinnost látky se stanoví v daných podmínkách porovnáním jejího účinku na zvýšení hmotnosti vaječníků infantilních samic potkana ošetřených choriovým gonadotropinem se stejným účinkem mezinárodního standardu lidského močového folikulostimulujícího a luteinizačního hormonu nebo referenční látky kalibrované v mezinárodních jednotkách. Mezinárodní jednotka FSH a LH j e účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu lidského močového folikulostimulujícího hormonu a luteinizačního (tj. hormonu stimulujícího intersticiální buňky), kterým j e směs lyofilizovaného extraktu z moči postmenopauzálních žen s laktosou. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Ke stanovení se vyberou infantilní samice potkana z jednoho kmene ve stáří 19 až 28 dní, u nichž věkový rozďíl je nejvýše 3 ďny a rozďíl hmotnosti mezi nejtěžším a nejlehčím zvířetem je nejvýše 10 g. Zvířata se náhodně rozdělí do šesti stejných skupin po nejméně pěti jedincích. Je-li dosažitelných šest samic z jednoho vrhu, rozdělí se po jedné do každé skupiny a označí se.

Zvolí se tři dávky referenční látky a tři dávky zkoušeného přípravku tak, aby nejnižší dávka vyvolala určitou měřitelnou reakci u části zvířat ve skupině a nejvyšší dávka submaximální odpověď u celé skupiny. Použijí se dávky v geometrické řadě a jako první pokus se doporučují celkové dávky 1,5 m.j., 3,0 m.j. a 6,0 m.j., avšak konečné dávkování závisí na citlivosti zvířat, která může značně kolísat.

Celková množství referenční látky a zkoušeného přípravku, která odpovídají denní dávce pro jednotlivé dávkové kategorie, se odděleně rozpustí v tlumivém roztoku fosforečnanu-albuminovém o pH 7,2 tak, aby denní dávka byla obsažena v objemu přibližně 0,5 ml. Tlumivý roztok obsahuje v denní dávce nejméně 14 m.j. choriogonadotropinu, aby se zajistila úplná luteinizace. Přidá se vhodná konzervační látka, jako např. fenol (4 g/l) nebo thiomersal (0,02 g/l). Takto připravená tři ředění referenční látky a tři ředění zkoušeného přípravku se uchovávají při teplotě (5 + 3) °C.

Při vlastním stanovení se třem skupinám infantilních samic vstříkne podkožně denní dávka roztoku referenční látky a třem skupinám roztoku zkoušeného přípravku (každé skupině jiné ředění) a podání se opakuje za 24 h a 48 h. Za 24 h od poslední injekce se samice usmrtí. Vypreparují se oba vaječníky, rychle se očistí od cizí tekutiny a tkáně, osuší a společně zváží. Průměrná hmotnost vaječníků v jednotlivých dávkových kategoriích je podkladem pro výpočet účinnosti za použití běžných statistických metod (5.3.3.2). Přesnost hodnocení výsledků je možno zvýšit vhodným přepočtem hmotnosti orgánů na celkovou tělesnou hmotnost příslušného zvířete a použít analýzu kovariance.

Stanovená účinnost přípravku je v rozmezí 80 % až 125 % účinnosti deklarované. Interval spolehlivosti (P = 0,95) účinnosti stanovené je v rozmezí 65 % až 156 % dekarované účinnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsném zabezpečeném obalu, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost folikulostimulujícího hormonu v obalu vyjádřená v mezinárodních jednotkách,
• účinnost folikulostimulujícího hormonu v miligramu vyjádřená v mezinárodních jednotkách,  
• zda je látka sterilní.