Vaccinum pertussis sine cellulis ex elementis praeparatum adsorbatum
1999
Adsorbovaná vakcína proti dávivému kašli z antigenních složek
Je to přípravek složený z individuálně vyrobených a purifikovaných antigenních složek Bordetella pertussis adsorbovaných na minerální nosič, jako je např. hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý.
Vakcína obsahuje bud' pertusový toxoid, nebo pertusovému toxinu podobný protein prostý toxických vlastností, produkovaný geneticky modifikovanou formou příslušného genu. Pertusový toxoid se připravuje z pertusového toxinu metodou, která jej učiní neškodným při zachování odpovídajících imunogenních vlastností a zabrání zpětné přeměně na toxin. Vakcína může též obsahovat filamentózní hemaglutinin, pertaktin (69 kD bílkovina zevní membrány) a jiné definované složky B. pertussis, jako jsou fimbriální-2 a fimbriální-3 antigeny. Poslední dva antigeny se mohou společně purifikovat. Antigenní složení a vlastnosti jsou založeny na průkazu ochrany a nepřítomnosti nežádoucích reakcí u populace, pro kterou je vakcína určena.
Výroba
Výrobní metoda má prokazatelně poskytovat stejnorodé vakcíny srovnatelné s vakcínou, která byla klinicky ověřena na účinnost a bezpečnost.
Jestliže se k výrobě použije geneticky modifikovaná forma B. pertussis, má být dodržování výrobního postupu a genetická stabilita v souladu s požadavky článku Producta ab ADN recombinante.
Referenční vakcína. Použije se šarže vakcíny s klinicky ověřenou účinností nebo reprezentativní šarže. Při výrobě reprezentativní šarže je nutné, aby byl přísně dodržen výrobní proces, který byl použit při výrobě klinicky zkoušené šarže. Referenční vakcína se přednostně stabilizuje metodou, u níž bylo prokázáno, že signifikantně neovliví~uje postup stanovení účinnosti, při němž se porovnává stabilizovaná a nestabilizovaná šarže.
Charakteristika složek
Při vývoji vakcíny se má výrobní proces validovat tak, aby se prokázalo, že se stále stejným způsobem získávají jednotlivé složky, které odpovídají následujícím požadavkům; prokáže-li se stálost výroby, není třeba běžně provádět zkoušení každé výrobní šarže.
Adenylát cykláza. Nejvýše 500 ng v množství odpovídajícím jedné dávce hotové vakcíny; stanoví se imunoblotovou analýzou nebo jinou vhodnou metodou.
Tracheální cytotoxin. Nejvýše 2 pmol v množství odpovídajícím jedné dávce hotové vakcíny; stanoví se vhodnou metodou, jako je např. biologické stanovení nebo kapalinová chromatografie (2.2.29).
Nepřítomnost zbytkového dermonekrotického toxinu. Třem neodstaveným myším se každé intradermálně vstříkne 0,1 ml obsahující množství složek nebo antigenních frakcí odpovídající jedné lidské dávce vakcíny. Zvířata se pozorují 48 h. Nezjistí se dermonekrotická reakce.
Specifické vlastnosti. Složky vakcíny jsou zkoušeny jednou nebo více metodami, uvedenými dále, aby se prokázala jejich totožnost a specifické vlastnosti (účinnost na množství jednotek bílkoviny) v porovnání s referenčními přípravky.
Pertusový toxin. Zkouší se in vitro metodou shlukování ovariálních buněk čínského křečka (CHO) a hemaglutinací; in vivo metodami stimulace lymfocytózy, senzibilizace na histamin a metodou sekrece insulinu. Toxin má ADP-ribosyl transferázovou účinnost při použití transducinu jako akceptoru.
Filamentózní hemaglutinin. Hemaglutinace a inhibice specifickými protilátkami. Pertaktin, fimbriální-2 a fimbriální-3 antigeny. Reakce se specifickými protilátkami.
Pertusový toxoid. Toxoid vyvolává u zvířat tvorbu protilátek, schopných inhibovat všechny vlastnosti pertusového toxinu.
Purifikované složky
Příprava každé složky je založena na systému jednotné inokulace. Kultury matečného inokula, ze kterých je toxin připravován, jsou uchovávány tak, aby se zajistila jejich toxinogenita. Je-li třeba, toxinogenita se obnovuje cíleným výběrem.
Žádná živná půda použitá při jakémkoliv stupni výroby neobsahuje lidskou krev ani výrobky z lidské krve. Pouze půdy použité pro přípravu matečného inokula nebo inokula mohou obsahovat zvířecí krev nebo přípravky ze zvířecí krve.
Pertusový toxin, kde je to vhodné, filamentózní hemaglutinin a pertaktin se purifikují a po vhodné charakterizaci detoxikují vhodnými chemickými látkami takovou metodou, která vylučuje zpětnou přeměnu toxoidu na toxin, a to zejména při uchovávání nebo působení tepla. Ostatní složky, jako jsou fimbriální-2 a fimbriální-3 antigeny, se purifikují bud' samostatně, nebo ve směsi a zkoušením se prokáže, že neobsahují toxické látky. Postup purifikace se validuje, aby se prokázalo dostatečné očištění od látek použitých při kultivaci nebo purifkaci.
Obsah bakteriálních endotoxinů (2.6.14) se stanoví jako ukazatel čisticího postupu a aby se limitovalo množství endotoxinů v hotovém přípravku. Limity určené pro jednotlivé složky jsou takové, aby vakcína obsahovala nejvýše 100 m.j. v jedné lidské dávce.
Čistota složek se před detoxikací stanoví vhodnou metodou, jako je např. elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) nebo kapalinová chromatografie. Charakteristiku subjednotek vakcíny je možno provést metodou SDS-PAGE nebo imunoblotovou analýzou se specifickými monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami. Pro každý jednotlivý přípravek se stanoví požadavky.
K přípravě konečné várky vakcíny se mohou použít pouze purifikované složky, které vyhovují následujícím požadavkům.
Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije množství purifikované složky odpovídající nejméně 100 dávkám.
Nepřítomnost zbytkového pertusového toxinu. Tato zkouška není nutná u přípravků získaných genetřckou modifikací. Nejméně pěti myším citlivým na histamin a o hmotnosti 18 g až 26 g se každé intravenózně vstříkne množství odpovídající jedné lidské dávce nebo intraperitoneálně dvěma lidským dávkám naředěné tlumivým roztokem fosforečnanovým s chloridem sodným a želatinou (2 g/l) na nejvýše 0,5 ml. Druhé skupině kontrolních myší se vstříkne ředicí roztok. Za 5 dní se intraperitoneálně vstříknou 2 mg histaminové báze v objemu nepřevyšujícím 0,5 ml a zvířata se pozorují 24 h. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže neuhyne žádná myš.
Používaný kmen myší se ve vhodných intervalech zkouší na citlivost k histaminu tímto postupem: podávají se trojnásobná ředění referenčního pertusového toxinu v tlumivém roztoku fosforečnanovém s chloridem sodným a želatinou (2 g/l) a čelenžují se histaminem, jak je uvedeno výše; kmen je vhodný, jestliže minimálně 50 % myší je senzibilizováno 50 ng pertusového toxinu a žádná z kontrolních myší, kterým byl podán pouze ředicí roztok a byly čelenžovány histaminem, nevykazuje známky přecitlivělosti.
Místo zkoušky na myších lze použít validovanou zkoušku shlukování ovariálních buněk čínského křečka (CHO).
Zbytky detoxikačních činidel a jiné látky. Stanoví se obsahy zbytků detoxikačních činidel a jiných látek a prokáže se, že jsou nižší než schválený limit, přičemž validace procesu má potvrdit přijatelné snížení.
Obsah antigenu. Obsah antigenu se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) a bílkovinový dusík mineralizací kyselinou sírovou (2.5.9) nebo jiným vhodným postupem. Poměr obsahu antigenu k množství bílkovinového dusíku je v rozmezí předepsaném pro přípravek.
Konečná várka vakcíny
Vakcína se připravuje adsorpcí vhodných množství purifikovaných složek bud' jednotlivě, nebo společně na hydroxid hlinitý nebo hydratovaný fosforečnan hlinitý. Může se přidat vhodná protimikrobní konzervační látka.
Pro přípravu šarže se může použít pouze konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.
Protimikrobní konzervační látka. Nejméně 85 % a nejvýše 115 % zamýšleného množství. Je-li to vhodné, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou.
Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška na sterilitu; na každou živnou půdu se použije 10 ml.
Šarže
Pouze šarže, která vyhovuje všem požadavkům uvedeným v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti, se může uvolnit k použití. Zkoušky na nepřítomnost zbytkového pertusového toxinu, stálost toxoidu, stanovení protimikrobní konzervační látky, zkouška na volný formaldehyd a stanovení účinnosti se mohou u šarže vypustit v případě, že tyto zkoušky byly provedeny u konečné várky vakcíny s vyhovujícím výsledkem.
Zkouška totožnosti
Vakcína se podrobí vhodné desorpci, např. tímto postupem: ve zkoušené vakcíně se rozpustí citronan sodný R na koncentraci 10 g/l, inkubuje se asi 16 h při 37 °C, poté se odstřed'uje, až vznikne čirý supernatant. Ten se zkouší vhodnou imunochemickou metodou (2. 7.1) a reaguje se specifickými antiséry proti jednotlivým složkám uvedeným v označení na obalu.
Zkoušky na čistotu
Nepřítomnost zbytkového pertusového toxinu. Tato zkouška není nutná u přípravku získaného genetickou modifikací. Nejméně pěti myším citlivým na histamin (viz Výroba) se každé intraperitoneálně vstříknou dvě lidské dávky. Druhé skupině kontrolních myší se podá ředící roztok. Za 5 dní se intraperitoneálně vstříknou 2 mg histaminové báze v objemu nepřevyšujícím 0,5 ml a zvířata se pozorují 24 h. Přípravek vyhovuje zkoušce, jestliže myši ze zkušební skupiny nevykazují citlivost na histamin.
Stálost toxoidu. Zkouška není nutná u přípravku získaného genetickou modifikací. Provede se zkouška na zbytkový pertusový toxin výše popsaným způsobem a použije se vakcína inkubovaná 4 týdny při teplotě 37 °C a současně se podává vzorek uchovávaný při 2 °C až 8 °C. Vakcína vyhovuje zkoušce, jestliže ani v jedné z obou skupin nedojde k úhynu na přecitlivělost na histamin.
Protimikrobní konzervační látka. Nejméně nejnižší prokazatelně účinné množství, nejvýše 115 % deklarovaného množství. Pokud je třeba, stanoví se obsah protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou.
Hliník. Je-li použit hydroxid hlinitý nebo hydratovaný fosforečnan hlinitý jako adsorbent, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.
Volný formaldehyd. Byl-li při výrobě vakcíny použit formaldehyd, vyhovuje vakcína zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.
Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.
Stanovení účinnosti.
Schopnost vakcíny indukovat tvorbu specifických protilátek se porovnává se stejnou schopností referenčního přípravku v souběžné zkoušce; protilátky se stanovují vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1), např. enzymově imunosorbentovým stanovením (ELISA). Zkouška na myších, která je dále uvedena, používá tříbodový model; po validaci při běžném zkoušení se může použít metoda jednoho ředění.
Požadavky. Schopnost indukovat tvorbu protilátek není významně (P = 0,95) nižší proti referenční vakcíně.
Následující modelová zkouška je příkladem metody, která byla shledána uspokojivou.
Výběr a rozdělení zkušebních zvířat. Použijí se zdravé myši (např. CD1 kmen) z jednoho chovu, 4 až 8 týdnů staré, a rozdělí se do šesti skupin ve vhodném počtu podle požadavků zkoušky. Použijí se tři ředění zkoušené vakcíny a tři ředění referenčního přípravku a ke každému ředění se určí jedna skupina zvířat. Každé myši se intraperitoneálně nebo subkutánně vstříkne 0,5 ml ředění určeného pro jeho skupinu.
Příprava vzorků sér. Za 4 až 5 týdnů po vakcinaci se myši jednotlivě vykrvácejí v narkóze. Séra se skladují při -20 °C do vyšetření na obsah protilátek.
Stanovení protilátek. Obsah specifických protilátek v jednotlivých sérech proti všem složkám vakcíny se stanoví validovanou metodou, jako je např. dále uvedené stanovení ELISA.
ELISA. Na povrch mikrotitrační destičky (z polyvinylchloridu nebo polystyrenu) se naváže specifický antigen v koncentraci 100 ng na jamku. Po opláchnutí se nenavázaná místa blokují inkubací s roztokem bovinního sérového albuminu a potom se opět opláchnou. Na destičkách se připraví dvojnásobné ředění sér myší imunizovaných zkoušenou a referenční vakcínou, inkubují se 1 h při 22 °C až 25 °C a poté se jamky promyjí. Do každé jamky se přidá vhodný roztok antimyšího IgG konjugovaného s enzymem a destička se inkubuje 1 h při 22 °C až 25 °C. Po jejím promytí se přidá substrát, ze kterého vázaný enzym uvolňuje chromofor, jehož množství se stanoví změřením Absorbance (2.2.25). Podmínky zkoušky se uspořádají tak, aby naměřené absorbance měly lineární průběh v závislosti na obsahu protilátek a jejich hodnoty absorbance byly v rozmezí 0,1 až 2,0.
Ve zkoušce se použije referenční antisérum o známé účinnosti, které slouží jako základ pro výpočet hladin protilátek ve zkoušených sérech. Ve zkoušce je též zařazeno standardizované kontrolní sérum.
Zkoušku lze hodnotit, jestliže:
Výpočet. Vypočítají se tury protilátek v sérech myší imunizovaných referenční a zkoušenou vakcínou a ze získaných hodnot se obvyklými statistickými metodami vypočítá účinnost zkoušené vakcíny ve vztahu k referenční vakcíně.
Uchovávání
Viz článek Vaccina ad usum humanum.
Označování
Viz článek Vaccina ad usum humanum. V označení na obalu se uvede: