Český lékopis 1997

Alteplasum ad iniectabile

1999

Alteplasa pro injekci

CAS 105857-23-6

Je to sterilní lyofilizovaná alteplasa, tkáňový plazminogenový aktivátor vyrobený technologií založenou na rekombinaci DNK. Její účinnost je nejméně 500 000 m:1. v miligramu bílkoviny.

Tkáňový plazminogenový aktivátor se váže na fibrinová vlákna a aktivuje plazminogen k tvorbě plazminu a k rozpouštění fibrinových vláken nebo krevních sraženin,

Alteplasa se skládá z 527 aminokyselina má relativní molekulovou hmotnost 59 050 bez uvažování uhlovodíků z poloviny vázaných v polohách Asn 117, Asn 184 a Asn 448. Celková relativní molekulová hmotnost je asi 65 000.

Alteplasa se plazminem štěpí mezi aminokyselinami v polohách 275 a 276 na dva řetězce (řetězec A a B), které jsou spojeny disulfidovou vazbou mezi Cys 264 a Cys 395. Jednořetězcová i dvouřetězcová forma mají srovnatelnou fibrinolytickou účinnost in vitro.

Výroba

Připravuje se biotechnologicky v buněčné kultuře metodou založenou na rekombinaci DNK; kultivace probíhá v médiu bez séra. Pripravek vyhovuje požadavkům článku Producta ab ADN recombinante.

Postup čištění je zaměřen na účinné odstranění možných nečistot, jako jsou antibiotika, DNK a kontaminace bílkovinami pocházejícími z hostitelské buňky a z výrobního média a možná virová kontaminace.

Je-li uchovávána nerozplněná, dokáže se její stabilita (udržení účinnosti) v zamýšlených podmínkách uchovávání.

Výroba, čištění a stejnorodost přípravku se kontrolují dále popsanými analytickými metodami běžně prováděnými při mezioperační kontrole.

Obsah bíkovin. Koncentrace bílkovin ve zkoušeném přípravku se stanoví změřením Absorbance (2.2.25) při 280 nm a 320 run proti předepsanému tlumivému roztoku. Je-li třeba, zředí se vzorky předepsaným tlumivým roztokem. Při výpočtu obsahu bílkovin se absorbance tlumivého roztoku odečte od absorbance roztoků vzorků. Pro výpočet koncentrace alteplasy se hodnota rozdílu absorbancí A280 - A320 děli specifickým absorpčním koeficientem, jehož hodnota pro alteplasy je 1,9.

Účinnost. Účinnost se stanoví in vitro z času potřebného k rozpuštění fibrinových vláken, jak je popsáno v odstavci Stanovení účinnosti. Specifická účinnost nerozplněné alteplasy je přibližně 580 000 m.j. v miligramu zkoušené látky.

N-terminální sekvence. Studium N-temiináliú sekvence se používá k ověřeni správného N-terminálního pořadí a k semikvantitativnímu určení dodatečného rozštěpení molekuly alteplasy, např. v poloze AA 275 - 276 nebo v poloze AA 27 - 28. N-terminální sekvence odpovídá sekvenci lidského buněčného aktivátoru plazminogenu.

Izoelektrická fokusace. Mikroheterogenní stejnorodost šarží zkoušeného přípravku vzniklá glykosylací molekuly alteplasy se může dokázat izoelektrickou fokusací (IEF). Vzorek se rozdělí při hodnotě pH mezi 6,5 a 8,5 do deseti hlavních a několika vedlejších zón. Podmínek denaturace se využije ke zřetelnému rozdělení různě nabitých variant alteplasy. Šírvka distribuce náboje závisí na populaci molekul, které se liší jemnou strukturou dvou a tH postranních řetězců komplexů uhlovodíkových zbytků s různým stupněm substituce sialovými kyselinami. Zóny zkoušených roztoků odpovídají zónám porovnávacího roztoku alteplasy.

Stanovení jednořetězcové alteplasy. Alteplasa vyrobená z buněk vaječníku čínského křečka v kultivačním médiu bez séra má převážně jeden řetězec. Jednořetězcová formace může být oddělena od dvouřetězcové gelovou permeační chromatografií za redukčních podmínek, které jsou popsány v odstavci Stanovení obsahu jednořetězcové látky, viz Zkoušky na čistotu. Obsah jednořetězcové alteplasy v nerozplněném přípravku je vyšší než 60 %.

Tryptické mapování peptidů. Primární struktura molekuly alteplasy se ověří tryptickým mapováním peptidů, jak je popsáno ve zkoušce totožnosti B. Redukovaná a karboxymethylovaná molekula je štěpena trypsinem asi na padesát peptidů, které se stanoví kapalinovou chromatografií na reverzní fázi. Získá se charakteristický chromatogram (otisk palce). Totožnost tryptického záznamu vzorku zkoušené látky s profilem dobře charakterizovaného referenčního přípravku je nepřímým potvrzením sekvence aminokyselin, neboť tímto citlivým postupem mohou být zjištěny i ojedinělé výměny aminokyselin v jednotlivých peptidech. Případně z peptidové mapy může být izolován komplex složek glykopeptidů a rozdělen v druhém směru bud' kapalinovou chromatografií na reverzní fázi, nebo kapilární elektroforézou. Touto dvojrozměrnou separací glykopeptidových variant se může ověřit mikroheterogenní stejnorodost glykosylace mezi šaržemi.

Tryptická peptidová mapa vzorků zkoušené látky má odpovídat tryptické peptidové mapě referenčního přípravku.

Obsah monomeru. Obsah monomeru se stanoví gelovou permeační chromatografií za neredukujících podmínek, jak je popsáno ve zkoušce Obsah monomeru (viz Zkoušky na čistotu). Obsah monomeru v přípravku je vyšší než 95 %.

Obsah alteplasy typu I a typu II. Buňky vaječníku čínského křečka produkují dvě glykosylační varianty alteplasy. Typ I obsahuje jednu polymannosní glykosylaci v poloze Asn 117 a dva glykosylační komplexy umístěné v polohách Asn 184 a Asn 448. Typ II je glykosylován pouze v polohách Asn 117 a Asn 448.

Poměr obou typů je stálý: 45 % až 65 % typu I a 35 % až 55 % typu II. Obsah typu I a typu II se může stanovit denzitometricky odečtením z gelu SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným). Plazminem upravené vzorky alteplasy, které jsou redukovány a karboxymethylovány před nanesením na gel, se rozdělí do tří zón: A-řetězcová alteplasa typu I (AA 1-275), A-řetězcová alteplasy typu II (AA 1-275) a B-řetězcová alteplasa (AA 276-527). Poměr alteplas typu I a typu II se stanoví z kalibrační křivky, která se získá denzitometricky z definovaných směsí standardů purifikovaných alteplas typu I a typu II.

SDS-PAGE. SDS-PAGE (barvené stříbrem) se používá k důkazu čistoty přípravku nerozplněné zkoušené látky a neporušenosti její molekuly. Na gelech SDS-PAGE se vzorky nerozplněné zkoušené látky nejsou v porovnání s referenční látkou patrny zóny odpovídající dalším bílkovinám nebo rozkladným produktům při nanášce 2,5 ug bílkoviny zkoušené látky a prahu detekce 5 ng pro. bílkoviny (hovězího sérumalbuminu).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 1 m.j. endotoxinu v miligramu zkoušené látky.

Sialové kyseliny. Nejdříve se dialyzují vzorky a referenční látka tlumivým roztokem (roztok chloridu sodného R (8,9 gn) a roztok octanu sodného R (4,1 g/l), hodnota pH 5,5) za použití membrány, jejíž práh propustnosti pro globuliny odpovídá relativní molekulové hmotnosti 10 000. Po dialyze se stanoví koncentrace bílkovin. Na 1 ml roztoku bílkoviny se přidá 5 µl roztoku chloridu vápenatého R 19,98% a na miligram bílkoviny se přidá 10 milijednotek neuraminidasy. Tento roztok se asi 17 h inkubuje při 37 °C.

Připraví se řada roztoků o koncentracích 1,56 mg/ml až 25,0 mg/ml za použití roztoku kyseliny N=acetylneuraminové R (50 mg/ml). Duplicitně se pipetou odměří po 0,2 ml každého vzorku přípravku a porovnávacího vzorku bílkoviny do každé zkumavky. Také se do každé zkumavky odmě ří po 0,2 ml od každé koncentrace porovnávacího roztoku kyseliny N-acetylneuraminové R. Přidá se 0,25 ml jodistanového zkoumadla (roztok jodistanu solného R (5,4 gn) v kyselině sírové R 1,25% (V/V), promíchá se a inkubuje 30 min při 37 °C. Přidají se 2,0 ml arsenitanového zkoumadla (roztoku arsenitanu sodného R (20 gn) v kyselině chlorovodíkové R 1,55% (V/V)) a promíchá se. Vznikne žlutohnědé zbarvení, které mizí. Přidají se 2,0 ml roztoku kyseliny thiobarbiturové R (28,9 g/l) a promíchá se. Uzavřené zkumavky se zahřívají ve vroucí vodní lázni 7,5 min a pak se 5 min chladí v ledové lázni. Přidají se 2,0 ml směsi 1-butanolu R a kyseliny chlorovodíkové R (95 : 5) a promíchá se. Zkumavky se odstřed'ují 3 min při 3000 ot/min. Absorbance vrstvy butanolu s kyselinou chlorovodíkovou se do 30 min měří při 552 nm proti směsi butanolu s kyselinou chlorovodíkovou. Pomocí lineární regresní analýzy se vytvoří kalibrační křivka porovnávacího vzorku N-acetylneuraminové kyseliny. Z kalibrační křivky se vypočítá počet molů N-acetylneuraminové kyseliny ve zkoušených vzorcích a v referenční látce alteplasy. Obsah sialových kyselin ve zkoušeném vzorku má být v rozmezí 70 % až 130 % sialovfch kyselin referenční látky, která obsahuje asi 3 moly kyseliny sialové v 1 molu alteplasy.

Neutrální cukry. Vzorky zkoušené a referenční látky se naředí v tlumivém roztoku (obsahujícím arginin R (34,8 g/l), polysorbát 80 R (0,1 g/l) a kyselinu fosforečnou R k nastavení hodnoty pH na 7,4) na koncentraci bílkoviny 50 μg/ml. Pro kalibrační křivku se ve stejném tlumivém roztoku připraví roztoky mannosy o následujících koncentracích: 20 μg/ml, 30 ltg/ml, 40 μg/ml, 50 pg/ml a 60 μg/ml. Do zkumavek se duplicitně odpipetuje po 2 ml těchto roztoků: zkoušeného roztoku, porovnávacího roztoku a z každé koncentrace mannosy. Do každé zkumavky se přidá 50 ul fenolu R a potom 5 ml kyseliny sírové R. Směs se promíchá a nechá se 30 min stát při pokojové teplotě. Absorbance každé zkumavky se měří při 492 nm. Obsah neutrálních cukrů se odečte z kalibrační křivky mannosy a udává se v molech neutrálního cukru na mol alteplasy. K výpočtu se uvažují zřeďovací faktory zkoušeného a porovnávacího roztoku a relativní molekulové hmotnosti mannosy (Mr 180,2) a alteplasy (Mr 59 050). Obsah neutrálních cukrů ve vzorcích zkoušené látky má být v rozmezí 70 % až 130 % obsahu neutrálních cukrů v referenční látce, která obsahuje asi 12 molů neutrálního cukru v molu alteplasy.

Vlastnosti

Bílý nebo nažloutlý prášek nebo tuhá drobívá hmota.

Přípravek se ředí podle doporučení v označení na obalu bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti, zkoušek na čistotu (kromě stanoveni rozpustnosti a obsahu vody) a stanovením účinnosti.

Zkoušky totožnosti

  1. Stanovení účinnosti slouží k ověření totožnosti přípravku.
  2. Provede se tryptické mapování peptidů za použití kapalinové chromatografie (2.2.29).

    Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se zředí vodou R tak, aby v 1 ml obsahoval 1 mg alteplasy. Asi 2,5 ml tohoto roztoku se dialyzuje přes membránu, jejíž práh propustnosti pro globuliny odpovídá relativní molekulové hmotnosti 10 000, nejméně 12 h roztokem obsahujícím močovinu R (480 gl/l), tris(hydroxymethylamino)methan R (44 g/l) a edetan disodný R (1,5 g/l), jehož pH bylo upraveno na hodnotu 8,6. Změří se objem roztoku, převede se do čisté zkumavky a na mililitr roztoku se pňdá 10 µl roztoku dithiothreitolu R (156 g/l). Nechá se stát 4 h, ochladí se v ledové lázni a na mililitr roztoku se přidá 25 µl čerstvě připraveného roztoku kyseliny jodocto-vé R (190 gl/l). Nechá se stát na temném místě 30 min. Pak se na mililitr roztoku přidá 50 µl roztoku dithiothreitolu, aby se ukončila reakce. Opět se dialyzuje po dobu 24 h roztokem hydrogenuhličitanu amon-ného R (8 g/l). Smíchá se 1 díl trypsinu pro peptidové mapování R na 100 dílů bílkoviny a nechá se 6 h až 8 h stát. Přidá se opět trypsin a nechá se stát celkem 24 h.

    Porovnávací roztok. Připraví se stejně jako zkoušený roztok, avšak místo zkoušeného přípravku se použije alteplasy CRL.

    Chromatogra%cký postup se obvykle provádí za použití:

    Kolona se ustaluje mobilní fází A pň průtokové rychlosti 1 ml/min. Po nástřiku vzorku se zvyšuje podíl mobilní fáze B o 0,44 % za minutu, dokud poměr mobilní fáze A ku mobilní fázi B nebude 60 : 40, a pak se zvyšuje o 1, 33 % za minutu, dokud poměr mobilní fáze A ku mobilní fázi B nebude 20 : 80, a pak se nechá promývat touto směsí 10 min. Zaznamená se chromatogram porovnávacího roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže rozlišení mezi 6. pikem (peptidy 268 až 275) a 7. pikem (peptidy 1 až 7) je nejméně 1,5; bo.s, a bo.sb jsou menší než 0,4 min. Nastříkne se asi 100 µl zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram. Totožnost piků se ověří srovnáním s píky porovnávacího roztoku. Neměly by být zjevné žádné další významné píky ani prodlevy. Významný pík je definován jednou plochou rovnající se nebo přesahující 5 % 19. píku (peptidy 278 až 296); nepřihlíží se k nevýznamným píkům. Chromatogram totožnosti citovaných piků je uveden na konci článku (obr. 1).

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. Rekonstituovaný přípravek je čirý (2.2.1) a není intenzívněji zbarven než porovnávací barevný roztok Ž7 (2.2.2, Metoda II).

Hodnota pH (2.2.3). 7,1 až 7, 5.

Rozpustnost. Přidá se množství kapaliny uvedené v označení na obalu. Přípravek se při teplotě 20 °C až 25 °C zcelá rozpustí do 2 min.

Obsah bílkovin. Připraví se roztok zkoušené látky o přesně známé koncentraci asi 1 g/l. Roztokem argininu R (34,8 gn), jehož pH bylo upraveno kyselinou fosforečnou R na hodnotu 7,3, se naředí přesně odměřený objem roztoku zkoušené látky tak, aby absorbance měřená v maximu při asi 280 nm byla od 0,5 do 1,0 (zkoušený roztok). Měří se Absorbance (2.2.25) roztoku v maximech při 280 nm a 320 nm proti roztoku argininu jako porovnávací tekutině. Obsah bílkovin ve zkoušeném vzorku se vypočítá podle vzorce:

V (A280 - A320) ,
1,9

v němž značí:

v - objem roztoku argininu potřebného k přípravě zkoušeného roztoku,
A280 - absorbanci v maximu při 280 nm,
A320 - absorbanci v maximu při 320 nm.

Obsah jednořetězcové alteplasy. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí ve vodě R tak, aby výsledná koncentrace byla asi 1 μg alteplasy v mililitru. Do zkumavky se odměn 1 ml tohoto roztoku, přidají se 3 ml roztoku dithiothreitolu R (3 gn) v mobilní fázi, zkumavka se uzavře a zahřívá se 3 min až 5 min při 80 °C.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Nastříkne se asi 50 µl zkoušeného roztoku a zaznamená se chromatogram. Chromatogram vykazuje dva hlavní píky odpovídající jednořetězcové a dvouřetězcové alteplasy. Relativní množství jednořetězcové alteplasy se vypočítá z hodnot ploch pí3ců. Zkoušku lze hodnotit, jestliže počet teoretických pater vypočtený na základě píku jednořetězcové alteplasy je nejméně 1000. Obsah jednořetězcové alteplasy má být nejméně 60 % z celkového nalezeného množství látek příbuzných alteplasy.

Obsah monomeru. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkoušený roztok. Zkoušený přípravek se rozpustí a zředí tak, aby se získala koncentrace asi 1 mg/ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

Nastříkne se zkoušený roztok a zaznamená se chromatogram Zkoušku lze hodnotit, jestliže počet teoretických pater přepočtený na pík monomeru alteplasy je nejméně 1000. Měří se odezva pro všechny píky, tj. pro píky odpovídající molekulovým hmotnostem různých typů alteplas. Vypočítá se relativní množství monomeru z hodnot ploch těchto píků. Obsáh monomeru alteplasy je nejméně 95 %.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 4,0 %.

Bakteriální endotoxiny (2.ó.14). Nejvýše 1 m.j. bakteriálního endotoxinu v miligramu bílkoviny.

Sterilita (2.ó.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním schopnosti zkoušeného přípravku aktivovat plazminogen k přeměně na plazmin se stejnou schopností referenčního přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Tvorba plazminu se měří stanovením doby rozpouštění fibrinových vláken za daných podmínek.

Mezinárodní jednotkou je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu alteplasy. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu alteplasy v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Tlumivý roztok. Je to roztok obsahující dihydrogenfosforečnan sodný monohydrátR (1,38 g/l), hydrogenfosforečnan sodný bezvodý R (7,10 g/l), azid sodný R (0,20 gn) a polysorbát 80 R (0,10 g/l); používá se k rozpouštění.

Roztok lidského trombinu. Roztok trombinu lidského R obsahující 33 m:1. v mililitru výše uvedeného tlumivého roztoku.

Roztok lidského fibrinogenu. Roztok fibrinogenu R (2 g/l) ve výše uvedeném tlumivém roztoku. Roztok lidského plazminogenu. Roztok lidského plazminogenu R (1 g/l) ve výše uvedeném tlumivém roztoku.

Zkoušené roztoky. Zkoušená látka se rozpustí ve výše uvedeném tlumivém roztoku na koncentraci 1 g/l a stejným tlumivým roztokem se vzorky naředí v poměrech např.: 1 : 5000,1 : 10 000 a 1 : 20 000.

Porovnávací roztoky. Použije se roztok alteplasy CRL o přesně známé koncentraci asi 1 g/l (580 000 m j. alteplasy v mililitru) a ředěnún vodou R se připraví pět postupně naředěných roztoků o známých koncentracích 9,0 m j./ml až 145 mj./ml.

Do každé z řady označených skleněných zkumavek se přenese 0,5 ml roztoku lidského trombinu a pro každou zkumavku se určí některý ze zkoušených nebo porovnávacích roztoků, které se do zkumavek přidají po 0,5 ml. Do každé z další řady označených zkumavek se odpipetuje 20 µl roztoku lidského plazminogenu a 1 ml roztoku lidského fibrinogenu, směs se promíchá a nechá se stát v ledové lázni. Začíná se se směsí, která obsahuje trombin a porovnávací roztok o nejnižší koncentraci, měří se čas a odděleně se přidá po 200 kel z každé z trombinových směsí do zkumavek obsahujících směs plazminogenu a fibrinogenu. Po celkovou dobu 15 s se vířením přerušovaně míchá obsah každé zkumavky a opatrně se umístí do stojánku v cirkulující vodní lázni při 37 °C. Do 30 s se objeví viditelné zakalení tvořící se sraženiny a současně ve sraženině vznikají bublinky.

Měří se čas rozpuštění sraženiny jako doba mezi prvním přídavkem roztoku alteplasy a okamžikem, kdy stoupá k hladině poslední bublinka. Použitím metody nejmenších čtverců se stanoví závislost 10garitmu koncentrací referenčního přípravku v m.j./ml proti 10garitmu doby rozpuštění sraženiny v sekundách, podle rovnice:

log t = a + b (log Us),

v níž značí:

t - dobu rozpuštění sraženiny,
Us - účinnost referenčního přípravku v m.j./ml,
b - je směrnice přímky,
a - je průsečík osy y a přímky.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže korelační koeficient je v rozsahu -0,9900 až -0,1000. Z rovnice a doby rozpuštění sraženiny ve zkoušeném roztoku se vypočítá 10garitmus účinnosti UA podle vztahu:

log UA = [(log t) - a] . 
b

Účinnost alteplasy v mezinárodních jednotkách v mililitru se vypočítá podle vzorce:

D · UA

v ňěmž značí:

D - zřeďovací faktor zkoušeného roztoku.

Specifická účinnost v navážce zkoušené látky se vypočítá podle vztahu:

UA ,
P

v němž značí:

P - koncentraci bílkoviny stanovenou v odstavci Obsah bílkovin, viz Zkoušky na čistotu.

Stanovená účinnost je v rozmezí 90 % až 110 % deklarované účinnosti.

Uchovávání

V bezbarvých skleněných obalech pod vakuem nebo pod inertním plynem při teplotě 2 °C až 30 °C, chráněna před světlem.

Separandum

Označování

V označení na obalu se uvede:

Následující typ chromatogramu je jen informační, je vodítkem a netvoří závaznou část článku.

Obr. 1. Vzorový chromatogram pro tryptické mapování peptidu alteplasy