Aprotinini solutio concentrata¹⁾

RZ2000

Koncentrovaný roztok aprotininu

Je to koncentrovaný roztok aprotininu, což je polypeptid složený z řetězce padesáti osmi aminokyselin. Stechiometricky inhibuje účinnost několika proteolytických enzymů, jako jsou chymotrypsin, kalikrein, plazmin a trypsin. Obsahuje nejméně 15,0 Ph.Eur.j. účinnosti aprotininu v mililitru.

Výroba

Kde je to vhodné, vyhovuje článku Producta cum possibili transmissione vectorium encephalopathiarum spongiformium animalium.

Zvířata, ze kterých se aprotinin získává, musí splňovat požadavky oprávněné autority na zdraví zvířat určených pro konzumaci lidmi.

Musí se dokázat, v jakém rozsahu dovolí výrobní postup inaktivaci nebo odstranění jakékoliv kontaminace viry nebo jinými původci infekce.

Metoda výroby je validována, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví následujícím zkouškám:

Neškodnost (2.6.9). Každé myši se ustříhne 0,5 ml roztoku zkoušeného přípravku ve vodě na injekci R obsahujícího množství odpovídající 2 Ph.Eur j.

Histamin (2.6.10). Nejvýše 0,2 pg báze histaminu ve 3 Ph.Eur.j.

Vlastnosti

Čirý bezbarvý roztok.

Zkoušky totožnosti

1. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R.

   Zkoušený roztok. Použije se roztok S, viz Zkoušky na čistotu. Porovnávací roztok. Použije se aprotinin roztok BRP.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R a kyseliny octové ledové R (80 + 100) obsahující 0,10 g octanu sodného R na 1 ml směsi po dráze 12 cm. Po vyjmutí z komory se vrstva usuší volně na vzduchu a postříká se roztokem 0,1 g ninhydrinu R ve směsi 6 ml roztoku chloridu měďnatého R (10 g/l), 21 ml kyseliny octové ledové R a 70 ml ethanolu R. Vrstva se usuší při 60 °C. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku polohou, zbarvením a velikostí odpovídá hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacíhoroztoku.

2. Stanoví se schopnost zkoušeného přípravku inhibovat účinnost trypsinu. Zkoušený roztok. 1 ml roztoku S se zředí tlumivým roztokem o pH 7,2 na 50 ml. Roztok trypsinu. 10 mg trypsinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0, 002 mol/l RS a zředí se jí na 100 ml. Roztok kaseinu. 0,2 g kaseinu R se rozpustí v tlumivém roztoku o pH 7,2 a zředí se jím na 100 ml. Srážecí roztok. Je to směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a ethanolu R (1 + 49 + 50).

   1 ml zkoušeného roztoku se smíchá s 1 ml roztoku trypsinu, směs se nechá 10 min stát, potom se přidá 1 ml roztoku kaseinu a inkubuje se 30 min při 35 °C. Směs se ochladí v ledové lázni, přidá se 0,5 ml srážecího roztoku a po protřepání se směs nechá stát 15 min při pokojové teplotě; roztok se zakalí. Postup se opakuje (slepá zkouška) s tlumivým roztokem o pH 7,2 místo zkoušeného roztoku; roztok zůstane čirý.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. Připraví se roztok obsahující 15 Ph.Eur.j. v mililitru. Připraví se, je-li třeba, ředěním podle účinnosti uvedené v označení na obalu zkoušeného přípravku.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1).

Absorbance (2.2.25). Připraví se roztok obsahující 3,0 Ph.Eur.j. v mililitru. Roztok vykazuje absorpční maximum při 277 nm a jeho absorbance v maximu je nejvýše 0,80.

Proteinové nečistoty o vyšší relativní molekulové hmotnosti. Zkoušený přípravek se lyofilizuje při tlaku 2,7 Pa a teplotě -30 °C. Lyofilizace, včetně dosušení při 15 °C až 25 °C, by měla trvat 6 h až 12 h. Zkouška se provede vylučovací chromatografií (2.2.30) za použití dextranu síťovaného pro chromatografii R2. K bobtnání gelu se použije roztok kyseliny octové bezvodé R (180 gn) a stejné rozpouštědlo se použije jako eluční roztok. Připraveným gelem se naplní chromatografická kolona o délce 0,8 m až 1,0 m a průměru 25 mm tak, aby sloupec neobsahoval vzduchové bubliny. Na horní konec sloupce se nanese množství zkoušeného přípravku odpovídající 300 Ph.Eur.j. rozpuštěné v 1 ml roztoku kyseliny octové bezvodé R (180 gn) a eluuje se stejným rozpouštědlem. Odebírají se eluáty po 2 ml a měří se Absorbance (2.2.25) každého odebraného eluátu v absorpčním maximu při 277 nm a naměřené hodnoty se vynesou do grafu. Na získaném chromatogramu není přítomno žádné absorpční maximum před elucí aprotininu.

Specifická účinnost vysušené látky. Nejméně 3,0 Ph.Eur.j. účinnosti v 1 mg vysušeného přípravku. 25,0 ml zkoušeného přípravku se odpaří na vodní lázni do sucha, zbytek se suší 15 h při 110 °C a zváží se. Vypočítá se počet Ph.Eur.j. připadající na 1 mg vysušené látky z hmotnosti vysušeného zbytku a účinnosti zjištěné při Stanovení účinnosti.

Sterilita (2.6.1). Pokud je přípravek určen k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Účinnost zkoušeného přípravku se stanoví měřením inhibičního působení na roztok trypsinu o známé účinnosti. Inhibiční účinnost se vypočítá z rozdílu mezi počáteční a zbytkovou účinností trypsinu.

Inhibiční účinnost zkoušeného přípravku se vyjadřuje v jednotkách Ph.Eur.j. 1 Ph.Eur.j. inhibuje 50 % enzymové účinnosti 2 pkat trypsinu.

Použije se reakční nádobka o objemu asi 30 ml vybavená temperovacím zařízením na (25 f 0,1) °C, míchadlem (např. magnetickým), uzávěrem s pěti otvory pro upevnění elektrod, špičky byrety, trubičky pro přívod dusíku a přidávání zkoumadel. Je možné použít manuální titraci nebo automatický titrátor. V případě manuální titrace má být byreta dělena po 0,05 ml a pH-metr má mít jemně dělenou stupnici a skleněnou a kalomelovou elektrodu.

Zkoušený roztok Vhodným ředěním (D) zkoušeného přípravku se připraví roztok v tlumivém roztoku boritanovém o pH 8,0 (0,001 S mol/l) tak, aby jeho koncentrace činila asi 1,67 Ph.Eur:1. v mililitru.

Roztok trypsinu. Připraví se roztok trypsinu CRL obsahující asi 0,8 pkat v mililitru (asi 1 mg/ml) v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS. Použije se čerstvě připravený roztok a před zkouškou se uchovává v ledové lázni. Roztok trypsinu a aprotininu. Ke 4,0 ml roztoku trypsinu se přidá 1,0 ml zkoušeného roztoku. Směs se okamžitě zředí na 40,0 ml tlumivým roztokem boritanovým o pH 8,0 (0,0015 molR), nechá se stát 10 min při pokojové teplotě a potom se uchovává v ledové lázni. Roztok je použitelný 6 h.

Zředěný roztok trypsinu. 0,5 ml roztoku trypsinu se zředí na 10,0 ml tlumivým roztokem boritanovým o pH 8,0 (0,0015 mol/l) a nechá se 10 min stát při pokojové teplotě a potom se uchovává v ledové lázni.

Reakční nádobka se nasytí dusíkem a za stálého míchání se přidá 9,0 ml tlumivého roztoku boritanového o pH8,0 (0,0015 mol/l) a 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku benzoylargininethylesterhydrochloridu R (6,9 g/l). Upraví se pH směsi na hodnotu 8,0 pomocí hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS. Po vytemperování nádobky na (25 f 0,1) °C se přidá 1,0 ml roztoku trypsinu a aprotininu a začne se měřit čas reakce. pH se udržuje na hodnotě 8,0 přidáváním hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS a zaznamenává se přidaný objem každých 30 s po dobu 6 min. Vypočte se počet mililitrů hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za 1 s (n, ml). Tato titrace se provede za stejných podmínek také se zředěným roztokem trypsinu. Vypočte se počet mililitrů hydroxidu sodného 0,1 mol/! VS spotřebovaného za 1 s (n2 ml).

Vypočte se účinnost v Ph.Eur j. v 1 mililitru ze vzorce:

4000 · (2n₂ - n₁) · D,

v němž značí:

D - zřeďovací faktor zkoušeného přípravku k získání koncentrace 1,37 Ph.Eur. v mililitru.

Nalezená hodnota účinnosti je v rozmezí 90 % až 110 % účinnosti uvedené v označení na obalu.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných zabezpečených obalech, chráněn před světlem.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet Ph.Eurj. v 1 mililitru,
• zda je přípravek sterilní,
• zda je přípravek prostý pyrogenních látek.

¹⁾ Pharmeuropa 12,1, 52 (2000). Závazné od 1. 1. 2000.