Aprotininum¹⁾

2000

Aprotinin

Je to polypeptid, který se skládá z řetězce padesáti osmi aminokyselin. Stechiometricky inhibuje účinnost několika proteolytických enzymů, jako jsou chymotrypsin, kalikrein, plazmin a trypsin. Obsahuje nejméně 3,0 Ph.Eur.j. účinnosti aprotininu v miligramu, počítáno na vysušenou látku.

Výroba

Kde je to vhodné, vyhovuje článku Producta cum possibili transmissione vectorium encephalopathiarum spongiformium animalium.

Zvířata, ze kterých se aprotinin získává, musí spliiovat požadavky oprávněné autority na zdraví zvířat určených pro konzumaci lidmi.

Musí se dokázat, v jakém rozsahu dovolí výrobní postup inaktivaci nebo odstranění jakékoliv kontaminace viry nebo jinými původci infekce.

Metoda výroby je validována, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví následujícím zkouškám:

Neškodnost (2.6.9). Každé myši se vstřikne O, S ml zkoušené látky ve vodě na injekci R obsahujícího množství odpovídající 2 Ph.Eur.j.

Histamin (2.6.10). Nejvýše 0,2 Kg báze histaminu ve 3 Ph.Eur j.

Vlastnosti

Téměř bílý hygroskopiský prášek. Je dobře rozpustný ve vodě a vizotonických roztocích, prakticky nerozpustný v organických rozpouštědlech.

Zkoušky totožnosti

1. Frovede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu G pro TLC R.

   Zkoušený roztok. Použije se roztok S, viz Zkoušky na čistotu. Porovnávací roztok. Použije se aprotinin roztok BRP.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R a kyseliny octové ledové R (80 + 100) obsahující 0,10 g octanu sodného R na 1 ml směsi po dráze 12 cm. Po vyjmutí z komory se vrstva usuší volnč na vzduchu a postříká se roztokem 0,1 g ninhydrinu R ve směsi 6 ml roztoku chloridu mědnatého R (10 g/l), 21 ml kyseliny octové ledové R a 70 ml ethanolu R. Vrstva se usuší při 60 °C. Hlavni skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku polohou, zbarvením a velikostí odpovídá hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku.

2. Stanoví se schopnost zkoušené látky inhibovat účinnost trypsinu.

   Zkoušený roztok. 1 ml roztoku S se zředí tlumivým roztokem o pH 7,2 na SO ml.

   Roztok trypsinu. 10 mg trypsinu CRL se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,002 molR RS a zředí se jí na 100 ml. Roztok kaseinu. 0,2 g kaseinu R se rozpustí v tlumivém roztoku o pH 7,2 a zředí se jím na 100 ml.

   Srážecí roztok. Je to směs objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a ethanolu R (1 + 49 + SO).

   1 ml zkoušeného roztoku se smíchá s 1 ml roztoku trypsinu, směs se nechá 10 min stát, potom se přidá 1 ml roztoku kaseinu a inkubuje se 30 min při 3S °C. Směs se ochladí v ledové lázni, přidá se O, S ml srážecího roztoku a po protřepání se směs nechá stát 1S min při pokojové teplotě; roztok se zakalí. Postup se opakuje (slepá zkouška) s tlumivým roztokem o pH 7,2 místo zkoušeného roztoku; roztok zůstane čirý.

Zkoušky na čistotu

Roztok S. Připraví se roztok obsahující 15 Ph.Eur;j. v mililitru. Koncentrace se stanoví podle účinnosti uvedené v označení na obalu zkoušené látky.

Vzhled roztoku. Roztok S je čirý (2.2.1).

Absorbance (1.2.25). Připraví se roztok obsahující 3,0 Ph.Eur.j. v mililitru. Roztok vykazuje absorpční maximum při 277 nm a jeho absorbance v maximu je nejvýše 0,80.

Proteinové nečistoty o vyšší relativní molekulové hmotnosti. Stanoví se vylučovací chromatografií (2.2.30) za použití dextranu sítbvaného pro chromatografii R2. K bobtnání gelu se použije roztok kyseliny octové bezvodé R (180 g/l) a stejné rozpouštědlo se použije jako eluční roztok. Připraveným gelem se naplní chromatografická kolona o délce 0,8 m až 1,0 m a průměru 2S mm tak, aby sloupec neobsahoval vzduchové bubliny. Na horní konec sloupce se nanese množství zkoušené látky odpovídající 300 Ph.Eur.j. rozpuštěné v 1 ml roztoku kyseliny octové bezvodé R (180 g/l) a eluuje se stejným rozpouštědlem. Odebírají se eluáty po 2 ml a měří se Absorbance (2.2.25) každého odebraného eluátu v absorpčním maximu při 277 nm a naměřené hodnoty se vynesou do grafu. Na získaném chromatogramu není přítomno žádné absorpční maximum před elucí aprotininu.

Ztráta sušením (2.2.32).. Nejvýše 6,0 %;suší se 0,100 g zkoušené látky ve vakuu.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Účinnost zkoušené látky se stanoví měřením inhibičního působení na roztok trypsinu o známé účinnosti. Inhibiční účinnost se vypočítá z rozdílu mezi počáteční a zbytkovou účinností trypsinu.

Inhibiční účinnost zkoušené látky se vyjadřuje v jednotkách Ph.Eur j. 1 Ph.Eur.j. inhibuje 50 % enzymové účinnosti 2 pkat trypsinu.

Použije se reakční nádobka o objemu asi 30 ml vybavená temperovacím zařízením na (25 t 0,1) °C, míchadlem (např. magnetickým), uzávěrem s pěti otvory pro upevnění elektrod, špičky byrety, trubičky pro přívod dusíku a přidávání zkoumadel. Je možné použít manuální titraci nebo automatický titrátor. V případě manuální titrace má být byreta dělena po 0,05 ml a pH-metr má mít jemně dělenou stupnici a skleněnou a kalomelovou elektrodu.

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v tlumivém roztoku boritanovém o pH 8,0 (0,0015 mol/l) tak, aby jeho koncentrace činila asi 1,67 Ph.Eur.j. v mililitru, tj. asi 0,6 mg (m mg) v mililitru.

Roztok trypsinu. Připraví se roztok trypsinu CRL obsahující asi 0,8 pkat v núlilitru (asi 1 mg/ml) v kyselině chlorovodíkové 0,001 mol/l RS. Použije se čerstvě připravený roztok a před zkouškou se uchovává v ledové lázni.

Roztok trypsinu a aprotininu. Ke 4,0 ml roztoku trypsinu se přidá 1,0 ml zkoušeného roztoku. Směs se okamžitě zředí na 40,0 ml tlumivým roztokem boritanovým o pH 8,0 (0,0015 mol/l), nechá se stát 10 min při pokojové teplotě a potom se uchovává v ledové lázni. Roztok je použitelný 6 h.

Zředěný roztok trypsinu. 0,5 ml roztoku trypsinu se zředí na 10,0 ml tlumivým roztokem boritanovým o pH 8,0 (0.0015 mol/l) a nechá se 10 min stát při pokojové teplotě a potom se uchovává v ledové lázni.

Reakční nádobka se nasytí dusíkem a za stálého míchání se přidá 9,0 ml tlumivého roztoku boritanového o pH 8,0 (0,0015 mol/l) a 1,0 ml čerstvě připraveného roztoku benzoylargininethylesterhydrochloridu R (6,9 g/I). Upraví se pH směsi na hodnotu 8,0 pomocí hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS. Po vytemperování nádobky na (25 t 0,1) °C se přidá 1,0 ml roztoku trypsinu a aprotininu a začne se měřit čas reakce. pH se udržuje na hodnotě 8,0 přidáváním hydroxidu sodného 0, I mol/l VS a zaznamenává se přidaný objem každých 30 s po dobu 6 min. Vypočte se počet mililitrů hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS za 1 s (nr ml). Tato titrace se provede za stejných podmínek také se zředěným roztokem trypsinu. Vypočte se počet mililitrů hydroxidu sodného 0,1 mol/l VS spotřebovaného za 1 s (nZ ml).

Vypočte se účinnost v Ph.Eur j. v 1 mililitru ze vzorce:

Nalezená hodnota účinnosti je v rozmezí 90 % až 110 % účinnosti uvedené v označení na obalu.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných zabezpečených obalech, chráněn před světlem.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• počet Ph.Eur j. v 1 miligramu,
• zda je látka sterilní,
• zda je látka prostá pyrogenních látek.

¹⁾ Pharmeuropa 12,1, 52 (2000). Závazné od 1. 1. 2000.