Český lékopis 1997

Heparina massae molecularis minoris

Nízkomolekulární hepariny

Jsou to soli sulfatovaných glukosaminoglykanů o průměrné molekulové hmotnosti menší než 8000, z nichž nejméně 60 % látky má molekulovou hmotnost menší než 8000. Jejich různá chemická struktura se projevuje na koncových skupinách polysacharidových řetězců, které jsou povahy redukující nebo neredukující.

Počítáno na vysušenou látku, je v miligramu nejméně 70 m.j. účinnosti protifaktoru Xa. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa podle postupu popsaného ve zkoušce Stanovení účinnosti činí nejméně 1,5.

Výroba

Při výrobě se používají postupy, které omezují na minimum možnost mikrobiální kontaminace. Získávají se frakcionací nebo depolymerizací heparinu přirozeného původu, který podle svého složení vyhovuje článku Heparinum natricum nebo Heparinum calcicum pro parenterální p oužití, pokud není zdůvodněno a schváleno jinak. Homogenita jednotlivých šarží pro každý typ nízkomolekulárního heparinu je zajištěna důkazem, např. takovým, že průměrná molekulová hmotnost a procentuální podíl látky v definovaném rozmezí molekulové hmotnosti nižší než 8000 jsou v rozmezí 75 % až 125 % průměrné hodnoty, kterou je typ specifikován. Stejné rozmezí platí též pro hodnotu poměru účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru IIa.

Nukleotidy a bílkovinné nečistoty v surovině. Před frakcionací se rozpustí 40 mg surového materiálu v 10 ml vody R. Absorbance (2.2.25) měřená při 260 nm a 280 nm není větší než 0,20, popř. 0,15.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý prášek, hygroskopický, snadno rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

  1. Provede se nukleární magnetická rezonanční spektrometrie (2.2.33) s použitím pulzního (Fourierova transformace) spektrometru, který pro 13C měří při 75 MHz.

    Zkoušený roztok. 0,200 g se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R. Porovnávací roztok. 0,200 g nízkomolekulárního heparinu CRL vhodné specifikace se rozpustí ve směsi 0,2 ml deuteriumoxidu R a 0,8 ml vody R.

    Spektra se zaznamenávají při 40 °C za použití kyvety o průměru 5 mm. jako vnitřní standard se použije methanol deuterizovaný R při b = 50,0 ppm.

    Spektrum zkoušeného roztoku se shoduje se spektrem porovnávacího roztoku obsahujícího nízkomolekulární heparin CRL vhodné specifikace.

  2. Poměr účinnosti protifaktoru Xa k účinnosti protifaktoru lIa stanovený podle postupu popsaného ve Stanovení účinnosti je nejméně 1,5.
  3. Provede se vylučovací chromatografie (2.2.30).

    Zkoušený roztok. 20 mg se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

    Porovnávací roztok. 20 mg nízkomolekulárního heparinu pro kalibraci CRL se rozpustí ve 2 ml mobilní fáze.

    Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

    Kalibrace systému. Nastříkne se 25 µl porovnávacího roztoku. Detekce se provádí diferenčním refraktometrem (1tI) spojeným do série s UV spektrofotometrem nastaveným na vlnovou délku 234 nm. UV monitor je připojen k výstupu z kolony a diferenční refraktometr k výstupu z UV monitoru.

    Je potřebné změřit přesně časový posun mezi oběma detektory, aby se mohly zaznamenané chromatogramy správně přiřadit. Pro kalibraci se použijí retenční časy získané 1tI detektorem.

    Normalizační faktor, používaný pro výpočet molekulové hmotnosti z poměru RI/UV, se získá takto: vypočítá se celková plocha pod křivkami UV 234(ΣUV234) a R1 (ΣRI) v požadovaném rozsahu (tj. bez píků soli a rozpouštědla na konci chromatogramu). Vypočítá se poměr r:

    ∑RI ,
    ∑UV234

    Vypočítá se faktor ƒ, který násobením hoďnotou r dává Mna(známou průměrnou molekulovou hmotnost kalibrační látky). Hoďnota Mna kalibrační látky je uvedena v přiloženém certifikátu:

    Mna ,
    r

    Jestliže j sou křivky UV z34 a RI správně přiřazeny, je možno molekulovou hmotnost v kterémkoliv bodě vypočítat podle vztahu:

    f RI ,
    UV234

    Nastříkne se 25 µl zkoušeného roztoku a zaznamenávají se chromatogramy po dobu, která zaručuje úplnou eluci píků zkoušené látky i rozpouštědla.

    Průměrná molekulová hmotnost látky j e vyj ádřena vztahem:

    ∑ (RIiMi) ,
    ∑RIi

    v němž značí:

    RIi - množství látky (hmoty) eluované ve frakci i,
    Mi - molekulovou hmotnost odpovídající frakci i.

    Hoďnota průměrné molekulové hmotnosti látky není větší než 8000 a nejméně 60 % celkové látky má molekulovou hmotnost menší než 8000, kromě toho se parametry molekulové hmotnosti zkoušené látky a odpovídající referenční látky neliší více než o 25 %.

  4. Vyhovuje zkoušce (a) na sodík nebo vápník (2.3.1), podle výchozí látky.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 5,5 až 8,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,1 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10 ml.

Dusík (2.5.9). 1,5 % až 2,5 %, počítáno na vysušenou látku.

Těžké kovy (2.4. 8). 0,5 g vyhovuje limitní zkoušce C na těžké kovy (30 µg/g). K přípravě porovnávacího roztoku se použije 1,5 ml základního roztoku olova (IO~g Pb/ml).

Vápník. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum calcicum, obsahuje 9,5 až 11,5 % Ca, počítáno na vysušenou látku. Vápník se stanoví chelatometrickou titrací (2.5.11) s 0,200 g zkoušené látky.

Sodík. Je-li připraven z heparinu, který vyhovuje článku Heparinum natricum, obsahuje 9,5 % až 12,5 % Na, počítáno na vysušenou látku. Sodík se stanoví atomovou absorpční spektrometrií (2.2.23, Metoda I).

Zkoušený roztok. 50 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS, která v mililitru obsahuje 1,27 mg chloridu cesného R. Roztok se stejným rozpouštědlem zředí na 100,0 ml.

Porovnávací roztoky. Připraví se porovnávací roztoky o koncentraci 25 µg Na/ml, 50 µg Na/ml a 75 µg Na/ml. K jejich přípravě se použije záklaďní roztoksodíku (200 μg Na/ml), který se zřeďí kyselinou chlorovodíkovou 0,1 mol/l RS obsahující v mililitru 1,27 mg chloridu cesného R.

Měří se absorbance při 330,3 nm zapoužití sodíkové lampy s dutou katodou jako zdroje záření a plamene vhodného složení (např. 11 litrů vzduchu a 2 litry acetylenu za minutu).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 10,0 %; 1,000 g se 3 h suší při 60 °C nad oxidem fosforečným R při tlaku nepřesahujícím 670 Pa.

Molární poměr sulfatových a karboxylatových skupin iontů. Nejméně 1,8. Stanoví se titraci za vodivostní indikace (2.2.38). Vzorek zkoušené látky použitý při této titraci neobsahuje ionizovatelné nečistoty, především soli.

0,100 g se naváží do malé kuželové baňky, přičemž se dbá na to, aby se předešlo problémům spojeným s hygroskopickými vlastnostmi látky. Přidá se 20 ml vody R, dvakrát destilované ve skle a ochladí na 4 °C. 2,0 ml tohoto roztoku se nanesou na předchlazenou kolonu (asi 10 cm x 1 cm) naplněnou vhodným katexem R. Kolona se promývá dvakrát ve skle vodou destilovanou R, která se zachycuje v titrační nádobě do konečného množství 10 ml až 15 ml. (Titrační nádoba musí být dostatečně velká, aby se do ní umístily elektrody z konduktometru, míchací tělísko a jemná ohebná trubička z vývodu 2ml byrety). Míchání je magnetické. Až jsou údaje na konduktometru konstantní, zaznamenají se a začne se titrovat hydroxidem sodným 0,05 mol/l VS, který se přidává v 50 µl dávkách. Vždy po přidání se za několik sekund zaznamenají údaje na byretě a na konduktometru. Titruje se do dosažení konečného bodu.

Pro každou naměřenou hodnotu se vypočítá množství miliekvivalentů přidaného hydroxidu sodného z objemu a známé koncentrace roztoku hydroxidu sodného. Do grafu se nanesou hodnoty vodivosti (na osu y) proti hodnotám miliekvivalentů hydroxidu sodného (na ose x). Graf má tři přibližně lineární části: počáteční klesající stupeň křivky, střední mírně vzrůstající a konečný prudc e vzrůstající stupeň křivky. Těmito třemi částmi grafu se proloží nejvhodnější přímky. Z bodů, v nichž se protne první přímka s druhou a druhá přímka s třetí, se spustí kolmice k ose x, na níž s e odečtou miliekvivalenty hydroxidu sodného spotřebovaného při titraci vzorku v daných bodech. Bod, v němž se protnou první a druhá přímka, udává množství miliekvivalentů hydroxidu sodného spotřebovaného sulfatovými skupinami a bod, v němž se protnou druhá a třetí přímka, udává množství miliekvivalentů spotřebovaných společně sulfatovými i karboxylatovými skupinami. Rozdíl mezi těmito dvěma hodnotami udává množství miliekvivalentů spotřebovaných karboxylatovými skupinami.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 0,01 m.j. endotoxiny v mezinárodní jednotce účinnosti protifaktoru Xa. Pro splnění validačních požadavků může být nezbytné přidání dvojmocných kationtů.

Stanovení účinnosti

Antikoagulační účinnost nízkomolekulárního heparinu se určí in vitro dvěma metodami, které stanoví jeho schopnost urychlovat inhibici faktoru Xa (anti-Xa zkouška) a trombinu, faktoru IIa (anti-IIa zkouška) antitrombinem III.

Mezinárodními jednotkami jsou účinnosti protifaktoru Xa a protifaktoru IIa obsažené v deklarovaném množství mezinárodního standardu nízkomolekulárního heparinu.

Nízkomolekulární heparin pro stanovení účinnosti BRP je kalibrován v mezinárodních jednotkách na mezinárodní standard dvěma dále uvedenými metodami.

Účinnost protifaktoru Xa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,025 m.j. až 0,2 m.j. účinnosti protifaktoru Xa v mililitru. Závislost mezi hodnotami absorbance a 10garitmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T p T2, T3 a T4 pro ředění zkoušené látky a písmeny S, , SL, ~ a ~ pro ředění referenčního přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 µl antitrombinu III RSI a 50 µl roztoku příslušného ředění zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. Ve voďní lázni nebo v tepelném bloku se uspořádají zkumavky v pořadí S, , SZ, S3, S4, T, , TZ, T3, T4, T, , TZ, T3, T4, S , ~ , ~ , aS a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 µl hovězího faktoru Xa RS. Přesně za 1 min inkubace se přidá 250 µ chromoforového substrátu Rl. Reakce se zastaví přesně za 4 min přidáním 375 µl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se Absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným postupem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na 10garitmech koncentrací zkoušené látky a referenčního přípravku nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinároďních jeďnotkách účinnosti protifaktoru Xa v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Účinnost protifaktoru IIa

Porovnávací a zkoušené roztoky. Připraví se čtyři nezávislé série se čtyřmi koncentracemi pro každou zkoušenou látku a referenční přípravek nízkomolekulárního heparinu v tlumivém roztoku trometamolovém o pH 7,4. Rozmezí koncentrací je 0,015 m.j. až 0,075 m.j. účinnosti protifaktoru IIa v mililitru. Závislost mezi absorbancí a 10garitmy koncentrací má být lineární.

Postup. Připraví se šestnáct zkumavek, které se vždy po dvou označí písmeny T1  T2, T3 a T4 pro ředění zkoušené látky a písmeny S, , SZ, ~ a ~ pro ředění porovnávacího přípravku. Do každé zkumavky se převede 50 µl antitrombinu III RS2 a 50 µl roztoku příslušné koncentrace zkoušené látky nebo referenčního přípravku. Pokaždé se roztok promíchá tak, aby nevznikly bubliny. V e voďní lázni nebo v tepelném bloku se zkumavky uspořádají v pořadí S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4, T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4 a ponechají se 1 min při 37 °C. Pak se do každé přidá 100 µl trombim lidského RS. Přesně za 1 min se přidá 250 µl chromoforového substrátu R2. Reakce se zastaví přesně za 4 min přidáním 375 µl kyseliny octové R. Obsah každé zkumavky se přenese do semimikrokyvety a změří se Absorbance (2.2.25) při 405 nm s použitím vhodného zapisovače. Slepé stanovení amidolytické účinnosti se provede na začátku a na konci měření stejným způsobem, pouze místo zkoušeného a porovnávacího roztoku se přidá tlumivý roztok trometamolový o pH 7,4. Naměřené hodnoty obou slepých zkoušek se významně neliší. Provede se regresní analýza závislosti absorbance na 10garitmech koncentrací zkoušené a referenční látky nízkomolekulárního heparinu a vypočítá se účinnost zkoušené látky v mezinárodních jeďnotkách účinnosti protifaktoru IIa v mililitru pomocí obvyklých statistických metod pro model rovnoběžnosti.

Uchovávání

Ve vzduchotěsných obalech. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilních vzduchotěsných zabezpečených obalech.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede: