Oxytocinum

2001

Oxytocin

Je to cyklický nonapeptid se strukturou hormonu produkovaného zadním lalokem hypofýzy. Stimuluje kontrakce dělohy a vylučování mléka u vnímavých savců. Získává se chemickou syntézou a je dostupný v lyofilizované formě jako octan. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, obsahuje 93,0 % až 102,0 % peptidu C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S2.

Pro komerční účely při označování oxytocinových přípravků odpovídá 1 mg peptidu oxytocinu (C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S2) 600 m.j. biologické účinnosti.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý hygroskopický prášek. Je velmi snadno rozpustný ve vodě a ve zředěných roztocích kyseliny octové a v ethanolu.

Zkouška totožnosti

Hodnotí se chromatogramy ze zkoušky Stanovení obsahu. Retenční čas hlavního píku na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá retenčnímu času hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 3,0 až 6,0; měří se roztok připravený rozpuštěním 0,200 g ve vodě prosté oxidu uhličitého R a zředěním stejným rozpouštědlem na 10,0 ml.

Aminokyseliny. Stanoví se analyzátorem aminokyselin. Přístroj se nastaví směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a [, -forem následujících aminokyselin:

a polovinu ekvimolárního množství t, -cystinu. K validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. norleucin R.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se naváží do pečlivě vymyté zkumavky z tvrzeného skla délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50% (VN). Zkumavka se vloží do mrazicí směsi při -5 °C, vytvoří se podtlak nepřevyšující 133 Pa a zataví se. Poté se 16 h zahřívá na 110 °C až 115 °C. Zkumavka se po ochlazení otevře a její obsah se převede do 10ml baňky pomocí pěti dávek vody R po 0,2 ml. Odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R. Zbytek se rozpustí ve vodě R a odpaří se do sucha za sníženého tlaku nad hydroxidem draselným R. Tento postup se ještě jednou opakuje. Zbytek se rozpustí v tlumivém roztoku vhodném pro použitý analyzátor aminokyselin a zředí se stejným tlumivým roztokem na vhodný objem. Do analyzátoru aminokyselin se odměří vhodný objem.

Obsah jednotlivých aminokyselin se vyjádří v molech. Relativní zastoupení aminokyselin se vypočítá z předpokladu, že jedna šestina součtu molů kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, prohnu, glycinu, isoleucinu a leucinu se rovná 1. Hodnoty pro jednotlivé aminokyseliny jsou v těchto rozmezích: kyselina asparagová 0,95 až 1,05; kyselina glutamová 0,95 až 1,05; prolin 0,95 až 1,05; glycin 0,95 až 1,05; leucin 0,90 až 1,10; isoleucin 0,90 až 1,10; tyrosin 0,7 až 1,05; polovina cystinu 1,4 áž 2,1. Ostatní aminokyseliny jsou přítomny jen ve stopách.

Příbuzné peptidy. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) za použití postupu popsaného ve Stanovení obsahu. Nastříkne se 50 µl zkoušeného roztoku. Na získaném chromatogramu není plocha žádného píku, kromě hlavního píku, větší než 1,5 % celkové plochy píků; součet ploch všech píků, kromě hlavního píku, není větší než 5 % celkové plochy píků. Nepřihlíží se k píkům rozpouštědla a k píkům, jejichž plocha je menší než 0,1 % plochy hlavního píku.

Kyselina octová (2.5.34). 6,0 % až 10,0 %.

Zkoušený roztok. 15.0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (5 + 95) a zředí se stejnou směsí rozpouštědel na 10,0 ml.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 5,0 %; stanoví se s nejméně 50 mg zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného sterilizačního postupu, vyhovuje zkoušce na sterilitu.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Pokud je látka určena k výrobě parenterálních přípravků bez dalšího vhodného postupu odstraňujícího bakteriální endotoxiny, vyhovuje zkoušce na bakteriální endotoxiny, obsahuje-li nejvýše 300 m.j. endotoxiny v miligramu.

Stanovení obsahu

Provede se kapalinová chromatogra%e (2.2.29).

Zkoušený roztok. Připraví se roztok zkoušené látky v roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l) tak, aby v mililitru obsahova10,25 mg oxytocinu.

Porovnávací roztok. Obsah lahvičky oxytocinu CRL se rozpustí v roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l) a zředí se jím na 20,0 ml.

Roztok pro rozlišení. Obsah lahvičky oxytocinldesmopressinu pro validaci CRL se rozpustí v SOO µl roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného R (15,6 g/l).

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,12 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 pm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 1 ml/min:
  • mobilní fáze A - roztok dihydrogenfósforečnanu sodného R (15,6 g/l),
  • mobilní fáze B - směs stejných objemových dílů acetonitrilu pro chromatografii R a vody R,

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
  0 - 30	70 → 40	30 → 60	lineární gradient
  30 - 30,1	40 → 70	60 → 30	návrat k počátečním podmínkám
  30,1 - 45	70	30	ustalování

• spektrofotometrického detektoru, 220 nm.

Kolona se promývá do ustavení rovnováhy směsí objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (30 + 70). Nastříkne se 25 µl roztoku pro rozlišení. Při zaznamenání chromatogramů za předepsaných podmínek jsou retenční časy: oxytocinu asi 7,5 min; desmopressinu asi 10 min. Zkoušku lze hodnotit, jestliže je rozlišení mezi píky desmopressinu a oxytocinu nejméně 5,0.

Nastřtlme se 25 µl porovnávacího roztoku a 25 µl zkoušeného roztoku. Obsah oxytocinu (C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S2) se vypočítá z ploch píků na chromatogramech zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku a z deklarovaného obsahu C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S2 v oxytocinu CRL.

Uchovávání

Ve vzduchotěsném obalu, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C. Je-li látka sterilní, uchovává se ve sterilním vzduchotěsném zabezpečeném obalu.

Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah peptidu oxytocinu (C₄₃H₆₆N₁₂O₁₂S2),  
• kde je to vhodné, že je látka sterilní,
• kde je to vhodné, že je látka prostá bakteriálních endotoxinů.