Tryptophanum¹⁾

RR99

Tryptofan

Synonymum. L-Tryptophanum

Je to kyselina (S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanová. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 98,5 % až 101,0 % sloučeniny C₁₁H₁₂N₂O₂.

Výroba

Je-li vyráběn fermentací, vyhovuje požadavkům článku Producta fermentationis.

Vlastnosti

Bílý nebo téměř bílý krystalický nebo amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96%, prakticky nerozpustný v etheru. Rozpouští se ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a minerálních kyselin.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A a B.

Alternativní sestava zkoušek: A, C a D, viz Obecné zásady (1.2.).

1. Zkouška Specifická optická otáčivost, viz Zkoušky na čistotu, je zároveí~ zkouškou totožnosti.
2. Infračervené absorpční spektrum (2.2.24) tablety zkoušené látky se shoduje se spektrem tablety tryptofanu CRL.
3. Hodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce Látky reagující s ninhydrinem, viz Zkoušky na čistotu. Hlavní skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) odpovídá polohou, zbarvením a velikostí hlavní skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku (a).
4. Asi 20 mg se rozpustí v 10 ml vody R, přidá se 5 ml dimethylaminobenzaldehydu RS6 a 2 ml kyseliny chlorovodíkové RS a zahřeje se na vodní lázni; vzniká nachově modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Vzhled roztoku. 0,1 g se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 1 mol/l RS a zředí se jí na 10 ml. Roztok je čirý (2.2.1) a není zbarven intenzívněji než porovnávací barevný roztok HŽ₆ (2.2.2, Metoda II).

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -30,0° až -33,0°, počítáno na vysušenou látku. Měří se následující roztok: 0,25 g se rozpustí, je-li třeba zahřátím na vodní lázni, ve vodě R a zředí se jí na 25,0 ml.

Látky reagující s ninhydrinem. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R.

Zkoušený roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 10 ml.

Zkoušený roztok (b). 1 ml zkoušeného roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R na 50 ml.

Porovnávací roztok (a). 10 mg tryptofanu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 50 ml.

Porovnávací roztok (b).5 ml zkoušeného roztoku (b) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R na 20 ml.

Porovnávací roztok (c). 10 mg tryptofanu CRL a 10 mg tyrosinu CRL se rozpustí ve směsi stejných objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R a zředí se stejnou směsí na 25 ml.

Na vrstvu se odděleně nanese po 5 µl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, vody R a 1-butanolu R (20 + 20 + 60) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, postříká se ninhydrinem RS a zahřívá se 15 min při 100 °C až 105 °C. Žádná skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku (a), kromě hlavní skvrny, není intenzívnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (0,5 %). Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) jsou dvě zřetelně oddělené skvrny.

1,1'-Ethylidenbistryptofan a jiné příbuzné látky. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Tlumivý roztok o pH 2,3. 3,90 g dihydrogenfosforečnanu sodného R se rozpustí v 1000 ml vody R, přidá se asi 700 ml roztoku kyseliny fosforečné R (2,9 g/l) a stejnou kyselinou se upraví pH na hodnotu 2,3.

Roztoky se připraví těsně před použitím.

Standardní roztok. 10,0 mg N-acetyltryptofanu R se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se zředí stejnou směsí na 100,0 ml.

Zkoušerrý roztok (a). 0,10 g se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Zkoušerrý roztok (b). 0,10 g se rozpustí ve standardním roztoku a zředí se j ím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (a). 1,0 mg 1, I'-ethylidenbistryptofanu R se rozpustí ve směsi objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) a zředí se stejnou směsí na 100,0 ml.

Porovnávací roztok (b).10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí standardním roztokem na 50,0 ml. Porovnávací roztok (c). 10,0 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) na 50,0 ml.

Porovnávací roztok (d). 0,10 g zkoušené látky se rozpustí v porovnávacím roztoku (c) a zředí se jím na 10,0 ml.

Porovnávací roztok (e). 1,0 ml porovnávacího roztoku (c) se zředí směsí objemových dílů acetonitrilu R a vody R (10 + 90) na 10,0 ml.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),
• mobilní fáze s průtokovou rychlostí 0,7 ml/min:
  • mobilní fáze A - směs objemových dílů acetonitrilu R a tlumivého roztoku o pH 2,3 (115 + 885),
  • mobilní fáze B - směs objemových dílů acetonitrilu R a tlumivého roztoku o pH 2,3 (350 + 650),
• gradientového programu za použití následujících podmínek:
  

  Čas (min)	Mobilní fáze A % (V/V)	Mobilní fáze B % (V/V)	Poznámky
  0 - 10	100	0	izokraticky
  10 - 45	100 → 0	0 → 100	lineární gradient
  45 - 65	0	100	izokraticky
  65 - 66	0 → 100	100 → 0	lineární gradient
  66 - 80	100	0	ustalování

  
  
• spektrofotometrického detektoru, 220 nm. Teplota kolony se udržuje na 40 °C.

Nastříkrne se 20 µl porovnávacího roztoku (b), 20 µl porovnávacího roztoku (d) a 20 µl porovnávacího roztoku (e). Jsou-li chromatogramy zaznamenány za předepsaných podmínek, retenční časy látek jsou: tryptofan asi 8 min, N-acetyltryptofan asi 29 min a 1,1'-ethylidenbistryptofan asi 34 min. Nastaví se citlivost systému tak, aby výška píku N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) byla nejméně 50 % celé stupnice zapisovače.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) rozlišení mezi píky N-acetyltryptofanu a 1,1'-ethylidenbistryptofanu je nejméně 8,0. Je-li třeba, upraví se gradientový program. Zvýšením mobilní fáze A v průběhu eluce se prodlouží retenční časy a zlepší se rozlišení; na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) je signál píku k šumu nejméně 15.

Nastříkne se 20 µl zkoušeného roztoku (a) a 20 µl zkoušeného roztoku (b). Zjistí se, není-li na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) pík se stejným retenčním časem, jako má pík N-acetyltryptofanu (v takovém případě se provede korekce píku N-acetyltryptofanu). Na chromatogramu zkoušeného roztoku (b) plocha píku odpovídajícího 1,1'-ethylidenbistryptofanu není větší než 0,5 násobek plochy hlavního píku na chromatogramu porovnávacího roztoku (e) (10 µg/g). Součet ploch všech píků s retenčním časem menším, než má tryptofan, není větší než 0,5 násobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (100 µg/g).

Součet ploch všech píků s retenčním časem větším, než má tryptofan, kromě píku N-acetyltryptofanu a píku do 1,8násobku retenčního času N-acetyltryptofanu, není větší než 1, Snásobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (300 µg/g). Nepřihlíží se k píkům s plochou menší než 0,02násobek plochy píku odpovídajícího N-acetyltryptofanu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).

Chloridy (2.4.4). 0,25 g se rozpustí ve 3 ml kyseliny dusičné zředěné RS a zředí se vodou R na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na chloridy (200 µg/g), bez dalšího přidání kyseliny dusičné.

Sírany (2.4.13). 0,5 g se rozpustí ve směsi objemových dílů kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vody destilované R (5 + 25) a zředí se stejnou směsí na 15 ml. Tento roztok vyhovuje limitní zkoušce na Sírany (300 µg/g).

Amonium (2.4.1). 0,10 g vyhovuje limitní zkoušce B na amonium (200 µg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 0,2 ml základního roztoku amonia (100 µg NH₄/ml).

Těžké kovy (2.4.8). 2,0 g vyhovují limitní zkoušce D na těžké kovy (10 µg/g). Porovnávací roztok se připraví za použití 2 ml základního roztoku olova (10 pg Pb/ml).

Železo (2.4.9). 0,50 g se rozpustí v dělicí nálevce v 10 ml kyseliny chlorovodíkové zředěné RS a vytřepává se třikrát 3 min vždy s 10 ml isobutylmethylketonu RI. Ke spojeným organickým vrstvám se přidá 10 ml vody R a třepe se 3 min. Vodná vrstva vyhovuje limitní zkoušce na železo (20 N~g/g).

Ztráta sušením (2.2.32). Nejvýše 0,5 %; 1,000 g se suší v sušárně při 100 °C až 105 °C.

Síranový popel (2.4.14). Nejvýše 0,1 %;stanoví se s 1,00 g zkoušené látky.

Stanovení obsahu

0,150 g se rozpustí ve 3 ml kyseliny mravenčí bezvodé R, přidá se 30 ml kyseliny octové bezvodé R a 0,1 ml naftolbenzeinu RS a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS .

1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 20,42 mg C₁₁H₁₂N₂O₂.

Uchovávání

V dobře uzavřených obalech, chráněn před světlem.

Nečistoty

1. kyselina 3,3'-[ethylidenbis(1H-indol-1,3-diyl)]bis[(2S)-2-aminopropanová] (1,1'-ethylidenbistryptofan),
2. kyselina (S)-2-amino-3-[(3RS)-3-hydroxy-2-oxo-2, 3-dihydro-1H-indol-3-yl]propanová (dioxyindolylalanin),  
3. kyselina (S)-2-amino-4-(2-aminofenyl)-4-oxobutanová (kynurenin),
4. kyselina (S)-2-amino-3-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)propanová (5-hydroxytryptofan),
5. kyselina (S)-2-amino-4-[2-(formylamino)fenyl]-4-oxobutanová (N-formylkynurenin),
6. kyselina (S)-2-amino-3-(fenylamino)propanová (3-fenylaminoalanin),
7. kyselina (S)-2-amino-3-(2-hydroxy-1H-indol-3-yl)propanová (2-hydroxytryptofan),
8. kyselina (3RS)-1,2, 3,4-tetrahydro-9H-β-karbolin-3-karboxylová,
9. kyselina 1-methyl-1,2, 3, 4-tetrahydro-9H-β-karbolin-3-karboxylová,
10. kyselina (S)-2-amino-3-{2-[2, 3-dihydroxy-1-(1H-indol-3-yl)propyl]-1H-indol-3-yl}propanová,
11. kyselina (S)-2-amino-3-[2-(1H-indol-3-ylmethyl)-1H-indol-3-yl]propanová,
12. kyselina 1-(1H-indol-3-ylmethyl)-1,2, 3, 4-tetrahydro-9H-β-karbolin-3-karboxylová.

¹⁾ Pharmeuropa 10,4, 551 (1998). Závazné od 1. l. 1999.