Antithrombinum III humanum densatum cryodesiccatum

Lyofilizovaný koncentrát humánního antitrombinu III

Je to přípravek tvořený glykoproteinovou frakcí získanou z lidské plazmy, který za přítomnosti přebytku heparinu inaktivuje trombin. Získává se z plazmy vyhovující požadavkům článku Plasma humanum ad separationem.

Po rozpuštění přípravku předepsaným způsobem v objemu rozpouštědla uvedeného v označení na obalu nebo v příbalovém letáku je účinnost antitrombinu III nejméně 25 m.j. v mililitru.

Výroba

Metoda přípravy zahrnuje postup nebo postupy, které prokazatelně odstraňují nebo inaktivuj í známá infekční agens. Jsou-li k inaktivaci virů použity v průběhu výroby nějaké látky, následující čisticí postupy se validují, aby se prokázalo, že koncentrace těchto látek je snížena na vhoďnou úroveň a že jejich zbytky neohrozí bezpečnost přípravku pro nemocné.

Antitrombin III se přečistí, zkoncentruj e a může se přidat vhodný stabilizátor. Specifická účinnost antitrombinu III je nejméně 3 m.j. v miligramu celkové bílkoviny bez albuminu. Koncentrát antitrombinu III se filtruje filtrem zadržujícím bakterie, asepticky se rozplní do konečných sterilních obalů a ihned se zmrazí. Pak se lyofilizuje a obaly se uzavřou ve vakuu nebo v atmosféře inertního plynu. V žáďném stupni výroby se nepřidávají protimikrobní konzervační látky.

Zkouška validace

Má se prokázat, že výrobním procesem vzniká přípravek, který pravidelně vyhovuje následující zkoušce:

Frakce vázající heparin. Frakce antitrombinu III schopná vazby na heparin je nejméně 60 %. Zkouší se elektroforézou v agarosovém gelu (2.2.31). Připraví se roztok agarosy pro elektroforézuR (10 g/l) v tlumivém roztoku barbitalovém o pH 8,4 obsahující 15 m.j. heparinu R v mililitru. 5 ml tohoto roztoku se naleje na čtvercovou skleněnou desku o straně 5 cm a chladí se 30 min při 4 °C. Vyříznou se dvě jamky o poloměru 2 mm, vzdálené 1 cm a 4 cm od strany desky a 1 cm od katody. Do jedné jamky se nanese 5 µl zkoušeného přípravku zředěného na roztok o účinnosti přibližně 1 m.j. antitrombinu III v mililitru. Do druhé jamky se nanese 5 µl značkovací barvy, jako např. modři bromfenolové RS. Nechá se působit při 4 °C elektrické pole 7 V/cm tak dlouho, až barva dosáhne anody.

V agarosovém gelu se udělá řez ve vzdálenosti 1,5 cm podél strany desky, kam byl nanesen zkoušený vzorek, a větší část gelu se odstraní. Zbývající proužek 1,5 cm široký obsahuje zkoušený materiál. Na volné místo se nalej e 3,5 ml roztoku agarosy pro elektroforézu R (10 g/l) v tlumivém roztoku barbitalovém o pH 8,4 obsahujícího králičí sérum proti lidskému antitrombinu III ve vhodné předem stanovené koncentraci, aby vznikl odpovídající pík o výšce nejméně 1,5 cm. Deska se umístí původním gelem směrem ke katodě, takže druhá elektroforetická migrace se děje v pravém úhlu k první. Druhá elektroforéza se nechá probíhat 16 h při konstantním elektrickém poli 2 V/cm. Desky se přelayjí filtračním papírem a několika vrstvami buničiny nasáklé roztokem chloridu sodného R (9 g/l) a na 2 h se zatíží. Solný roztok se několikrát vymění. Desky se opláchnou vodou R, usuší se a obarví modří kyselou 92 RS.

Frakce antitrombinu III vázaného na heparin, což je píle bližší k anodě, se vypočítá z celkového množství antitrombinu III změřením ploch dvou precipitačních piků.

Vlastnosti

Bílá sypká látka nebo prášek.

Zkoušený přípravekse rozpustí předepsaným způsobem bezprostředně před provedením zkoušek totožnosti, zkoušek na čistotu (s výjimkou rozpustnosti, stanovení celkového proteinu a vody) a stanovení účinnosti.

Zkoušky totožnosti

1. Se zkoušeným přípravkem se provedou precipitační zkoušky s vhodným rozsahem druhou ě specifických sér. Doporučuj e se provést tyto zkoušky se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám všech druhů domácích zvířat obvykle používaných v dané zemi k přípravě materiálů biologického původu. Gely se obarví modří kyselou 92 RS. Přípravek obsahuje bílkoviny lidského původu a dává negativní reakce se specifickými séry proti plazmatickým bílkovinám ostatních druhů.

2. Stanovení účinnosti antitrombinu III přispívá k důkazu přípravku.

Zkoušky na čistotu

Hodnota pH (2.2.3). 6,0 až 7,5; měří se rozpuštěný přípravek.

Rozpustnost. Rozpustí se úplně za mírného míchání do 10 min v objemu rozpouštědla uvedeného v označení na obalu nebo v příbalovém letáku; vytvoří se čirý nebo slabě zakalený bezbarvý roztok.

Osmolalita (2.2.35) Nejméně 240 miliosmolů na kilogram.

Celkové bílkoviny. Je-li nezbytné, zředí se přesně změřený objem zkoušeného přípravku vodou R na roztok obsahující přibližně 15 mg bílkoviny ve 2 ml. Ke 2,0 ml roztoku v centriµgační zkumavce se přidají 2 ml roztoku molybdenanu sodného R (75 g/l) a 2 ml směsi objemových dílů kyselinry sírové prosté dusíku R a vody R (1 + 30). Protřepe se, odstřed'uje se 5 min, supernatantní tekutina se sleje a převrácená zkumavka se nechá odkapat na filtrační papír. Ve zbytku se stanoví dusík mineralizací s kyselinou sírovou (2.5.9) a obsah bílkovin se vypočítá vynásobením výsledku faktorem 6,25.

Heparin (2.7.5) Nejvýše 0,1 m.j. účinnosti heparinu na mezinárodní jeďnotku účinnosti antitrombinu III. Je nutné validovat metodu stanovení heparinu pro každý specifický zkoušený přípravek vzhledem k interferenci s antitrombinem III.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %, provede se s nejméně 0,500 g zkoušené látky.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje ve zkoušce na sterilitu.

Stanovení účinnosti.

Obsah antitrombinu III ve zkoušeném přípravku se stanoví porovnáním jeho schopnosti inaktivovat za přítomnosti přebytku heparinu trombin se stejnou schopností referenčního přípravku koncentrátu antitrombinu III kalibrovaného v mezinárodních jednotkách. Proměnná množství zkoušeného přípravku se smíchají s neměnným množstvím trombinu a zbývající aktivita trombinu s e stanoví za pomoci vhodného chromogenního substrátu.

Mezinároďní jeďnotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinároďníco standardu koncentrátu lidského antitrombinu III. Hoďnotu účinnosti mezinároďního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Postup zkoušky. Připraví se dvě nezávislé řady tří nebo čtyř ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku v rozmezí 1/75 až 1/200 z 1 m.j./ml v tlumivém roztoku trometamol-albuminovém o pH8,4 obsahujícím 15 m.j. heparinu v mililitru.

200 µl každého ředění se 1 min až 2 min zahřívá při 37 °C. Všechna ředění se smíchají s 200 µl roztoku trombinu hovězího R o účinnosti 2 m.j./ml v tlumivém roztoku trometamolalbuminovém o pH 8,4. Míchá se a udržuje se 1 min přesně na 37 °C. Přidá se 500 µl vhodného chromogenního substrátu (např. D-fenylalanyl-L-pipelcolyl-L-arginyl-4-nitroanilid rozpuštěný předepsaným způsobem ve vodě R na roztok o koncentraci 4 mmol/l a dále naředěný pro zkoušku tlumivým roztokem trometamolovým s edetanem disodným o pH 8,4 na koncentraci vhodnou pro stanovení). Okamžitě se začne měřit změna absorbance při 405 nm, v měření se pokračuje nejméně 30 s. Vypočítá se rychlost změny absorbance (ΔA/min). (Zkouška může být alternativně provedena tak, že se reakce ukončí přidáním kyseliny octové a změří se absorbance při 405 nm.)

Rychlost změny absorbance (ΔA/min) je nepřímo úměrná účinnosti antitrombinu III. Úbytek absorbance nebo ΔA/min se vynese proti koncentraci na lineární stupnici a účinnost se odečte ze směrnic přímek pro referenční a zkoušený přípravek.

Ověří se validita Zkoušky a účinnost zkoušeného přípravku se vypočítá obvyldými statistickými metodami pro stanovení poměru sldonů (např. 5.3 Statistické analýzy výsledků biologických zkoušek).

Stanovená účinnost je nejméně 90 % a nejvýše 110 % účinnosti uvedené v označení na obalu. Interval spolehlivosti (P= 0,95) je nejméně 90 % a nejvýše 110 % stanovené účinnosti.

Uchovávání

Uchovává se chráněn před světlem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• obsah antitrombinu III v obalu v mezinárodních jednotkách,
• název a objem rozpouštědla, jež se použije k rozpuštění přípravku,
• je-li potřebné, množství albuminu přidaného jako stabilizátor.