Český lékopis 1997

Vaccinum haemophili stirpe b conjugattum1)

2001

Konjugovaná vakcína proti hemofilu typu b

Je to tekutý nebo lyofilizovaný přípravek obsahující polysacharid získaný z vhodného kmene Haemophilus influenzae typ b, kovalentně vázaný na bílkovinný nosič. Polysacharid polyribosylribitolfosfat, označovaný jako PRP, je lineární kopolymer složený z opakujících se jednotek 3-R-D-ribofuranosyl-(1~1)-ribitol-5-fosfatu [(C10H19O12P)n] s definovanou molekulovou hmotností. Bílkovinný nosič, je-li konjugován s PRP, je schopen navodit na T-buňkách závislou B-buněčnou imunitní odpověd' na tento polysacharid.

Vakcína vyhovuje článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Všeobecná ustanovení

Výrobní proces má prokazatelně poskytovat stále stejné vakcíny, které jsou u lidí dostatečně imunogenní a neškodné. Výroba PRP a nosiče je založena na systému jednotné inokulace.

Výrobní postup se validuje, aby se prokázalo, že pokud bude výrobek zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost imunních sér a vakcín pro humánní použití (2.6.9).

Během vývojových studií a kdykoli je nezbytná revalidace výrobního procesu, prokazuje se zkouškami na zvířatech, že vakcína pravidelně indukuje na T-buňkách závislou B-buněčnou imunitní odpověď.

Stabilita šarže a odpovídajících meziproduktů se hodnotí jednou nebo více vybranými zkouškami. Tyto zkoušky mohou zahrnovat stanovení velikosti molekul, stanovení volného PRP v konjugátu a stanovení imunogenity u myší. Na základě výsledků stabilitních zkoušek se vytyčí pro tyto zkoušky požadavky na propuštění, aby se zajistilo, že vakcína bude na konci doby platnosti ještě uspokojivá.

Bakteriální inokula

Barvením podle Grama a inokulací na vhodné půdy se prokáže, že matečné inokulum H. influenzae typu b neobsahuje kontaminující látky. Několik zorných polí se při velkém zvětšení vyšetří tak, aby bylo prohlédnuto nejméně 10 000 mikroorganismů.

V tekutinách použitých pro udržení životnosti kmene se nepoužijí složité produkty živočišného původu, a to ani pro lyofilizaci nebo pro zmražování.

Doporučuje se PRP připravený jednotnou inokulací charakterizovat použitím nukleární magnetické rezonanční spektrometrie (2.2.33).

Polysacharid H. influenzae typu b (PRP)

H. influenzae typu b se pomnoží v tekuté půdě, která neobsahuje vysokomolekulární polysacharidy; jestliže některá složka půdy obsahuje krevní substance, postup se validuje, aby se dokázalo, že po purifikačních krocích nejsou tyto substance dále detegovatelné. Bakteriální čistota kultury se prokazuje vhodnými metodami. Kultura může být inaktivovaná. PRP je separován z tekuté kultury a purifikován vhodnou metodou. Těkavé látky, včetně vody, se v purifikovaném polysacharidu stanoví vhodnou metodou, jako je termogravimetrie (2.2.34); výsledek se použije k přepočtu výsledků jiných zkoušek na vysušenou látku, jak je popsáno dále.

Pouze PRP, který vyhoví následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu konjugátu.

Totožnost. PRP se dokáže imunochemickou metodou (2.7.1) nebo jinou vhodnou metodou, např.'H nukleární magnetickou rezonanční spektrometrií (2.2.33).

Distribuce molekulové velikosti. Procento PRP vymývané před danou hodnotou Ko nebo v rozsahu hodnot Ko se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30). Přijatelná hodnota je stanovena pro jednotlivé přípravky a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje této hodnotě. Pro informaci jsou v tabulce 1 uvedeny limity pro schvalované výrobky za použití uvedených stacionárních fází. Kde je to vhodné, stanoví se také distribuce velikosti molekul po chemické modifikaci polysacharidu.

Pro stanovení distribuce molekulové velikosti se může použít také kapalinová chromatografie (2.2.29) s detektorem na bázi víceúhlového rozptylu světla.

Validované stanovení stupně polymerizace nebo váženého průměru hmotnosti molekul a disperze molekulových hmotností se mohou použít místo stanovení distribuce molekulové velikosti.

Ribosa (2.5.31). Nejméně 32 %; počítáno na vysušenou látku.

Fosfor (2.5.18). 6,8 % až 9,0 %;počítáno na vysušenou látku.

Bílkoviny (2.5.16). Nejvýše 1,0 %; počítáno na vysušenou látku. K detekci bílkovin v koncentraci 1% nebo vyšší se použije dostatečné množství PRP.

Nukleová kyselina ( 2.5.17). Nejvýše 1,0 %, počítáno na vysušenou látku.

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. endotoxinu v mikrogramu PRP.

Zbytkové látky. Kde je to vhodné, provádějí se zkoušky na stanovení zbytkových látek použitých při inaktivaci a purifikaci. Přijatelná hodnota pro každou látku je stanovena pro jednotlivý přípravek a každá šarže PRP prokazatelně vyhovuje limitu. Jestliže validační studie prokázaly odstranění zbytkových látek, zkouška u PRP se může vypustit.

Bílkovinný nosič

Bílkovinný nosič je vybrán tak, aby po konjugaci s PRP byl schopen indukovat na T-buňkách závislou B-buněčnou imunitní odpověď. Povolené nosiče a konjugační metody jsou uvedeny v tabulce 1. Bílkovinný nosič je produkován v kultuře vhodných mikroorganismů, ověřené na bakteriální čistotu. Kultura může být inaktivovaná; bílkovinný nosič je purifikován vhodnou metodou.

Pouze bílkovinný nosič, který vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít k výrobě konjugátu.

Totožnost. Zkouška totožnosti se provede vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1).

Tab. 1 Charakteristiky přípravku a specifikace pro PRP a bílkovinný nosič u běžně schválených přípravků

Typ

Nosič Hemofilový polysacharid Konjugace
Typ Čistota Množství na dávku PRP Množství na dávku Metoda spojování Postup
difterický toxoid > 1500 Lf mg dusíku na 18 µg PRP redukovaná velíkost
Ko: 0,6 - 0,7; použije se agarosa sítóvaná pro chromatografii R
25 µg aktivace PRP bromkyanem aktivovaný difterický toxoid (D-AH+), bromkyanem aktivovaný PRP
tetanický toxoid > 1500 Lf na mg dusíku 20 µg PRP ≥ 50 % ≤ Ko:
0,30; použije se agarosa síťovaná pro chromatografii R
10 µg zprostředkovaně karbodiimidem ADH-aktivovaný PRP (PRP-cov.-AH) + tetanický toxoid + EDAC
CRM 197 difterická bílkovina > 90 % difterické bílkoviny 25 µg PRP redukovaná velikost
Dp = 15 - 35
nebo 10 - 35
10 µg reduktivní aminace (jednostupňová metoda) nebo N-hydroxy sukcinimidová aktivace přímé navázání PRP na CRM 197 (aktivované kyanotrihydroboratem)
komplex bílkovin vnější membrány meningokoka skupiny B(OMP) bílkoviny vnější membrány 8 % lipopolysacharidu 125 µg nebo 250 pg PRP redukovaná veli kost Ko < 0,6; použije se agarosa sítóvaná pro chromatografii R nebo MW>50 103 7,5 Ftg nebo 15 µg thioetherová vazba PRP aktivovaný CDi PRP-IM + BuA2 + BrAc = PRP-BuA2-BrAc+ thioaktivovaný OMP

Vysvětlivky

ADH - dihydrazid kyseliny adipové Dp - stupeň polymerace
BrAc - bromacetylchlorid EDAC - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid
BuA2 - butan-l, 4-diamid IM - imidazolium
CDI - karbonyldiimidazol MW - vážený průměr molekulové hmotnosti

Sterilita (2.6.1). Na každou půdu se inokuluje 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho, co je méně.

Difterický toxoid. Difterický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vacciraum diphtheriae a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifikovaného toxoidu.

Tetanický toxoid. Tetanický toxoid se vyrábí tak, jak je popsáno v článku Vacciraum tetanickm adsorbatum a vyhovuje požadavkům předepsaným pro várku purifikovaného toxoidu, vyjma antigenní čistoty; nejméně 1500 Lf na miligram bílkovinného dusíku.

Difterická bílkovina CRM 197. Obsahuje nejméně 90 % difterické CRM 197 bílkoviny, stanovené vhodnou metodou. Provádějí se vhodné zkoušky bud' pro validaci, nebo běžně, aby se prokázalo, že přípravek není toxický.

OMP (komplex bílkovin vnější membrány meningokoka skupiny B). OMP vyhovuje následujícím požadavkům pro lipopolysacharidy a pyrogenní látky.

Lipopolysacharidy. Nejvýše 8 % lipopolysacharidů, stanoveno vhodnou metodou.

Pyrogenní látky (2.6.8). Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně 0,25 ltg OMP.

Várka konjugátu

PRP je chemicky modifikován k umožnění konjugace: obvykle je částečně depolymerován před nebo během tohoto procesu. Před konjugací mohou být do bílkovinného nosiče nebo PRP zavedeny reaktivní funkční skupiny nebo vazebné můstky (spacery). Konjugát se získá kovalentní vazbou PRP a bílkovinného nosiče. Kde je to vhodné, nezreagované funkční skupiny se schopností potenciálně reagovat se blokují vhodnými krycími činidly; konjugát se čistí, aby se tyto látky odstranily.

Pouze várka konjugátu, která vyhovuje následujícím předpisům, se může použít k přípravě konečné várky vakcíny. Pro každou zkoušku a každý jednotlivý přípravek jsou stanoveny limity přijatelnosti a každá šarže konjugátu prokazatelně vyhoví těmto limitům. Limity těchto zkoušek, vztahující se na běžně schválené přípravky, jsou uvedeny v tabulce 2. Pro lyofilizovanou vakcínu mohou být některé ze zkoušek provedeny spíše v šarži než ve várce konjugátu, neboť lyofilizační postup může ovlivnit zkoušenou složku.

PRP. Obsah PRP se určí ze stanoveni fosforu (2.5.18) nebo ze stanovení ribosy (2.5.31) nebo některou imunochemickou metodou ( 2.7.1).

Bílkoviny. Obsah bílkovin se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (např. 2.5.16). Poměr PRP k bílkovinám. Poměr se stanoví výpočtem.

Distribuce velikostí molekul. Distribuce velikostí molekul se stanoví vylučovací chromatografií (2.2.30).

Volný PRP. Nenavázaný PRP se stanoví po odstranění z konjugátu, např. iontovou vylučovací chromatografií, vylučovací chromatografií nebo hydrofobní chromatografií, ultrafiltrací nebo jinou validovanou metodou.

Volný bílkovinný nosič. Stanoví se vhodnou metodou bud' přímo, nebo odvozením obsahu výpočtem z výsledků ostatních zkoušek. Množství je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Nezreagované funkční skupiny. Žádné nezreagované funkční skupiny nelze ve várce konjugátu detegovat, jestliže postup validace neprokázal, že nezreagované funkční skupiny detegovatelné v tomto stadiu se odstraní při následujících výrobních krocích (např. vzhledem ke krátkému poločasu).

Zbytkové látky. Odstranění zbytků Látek, jako jsou kyanid, EDAC a fenol, se prokáží vhodnými zkouškami nebo validací výrobního postupu.

Sterilita (2.6.1). Provede se zkouška, při níž se na každou půdu použije 10 ml nebo ekvivalent 100 dávek, podle toho co je méně.

Tabulka 2 Požadavky na várku konjugátu pro běžně schválené přípravky

Zkouška Bílkovinný nosič
Difterický toxoid Tetanický toxoid CRM 197 OMP
volný PRP < 37 % < 20 % < 25 % < 15
volná bílkovina < 4 % < 1 %,
je-li prováděno
< 1 % nebo < 2 %,
záleží na použité metodě spojení 
neprovádí se
poměr PRP k bílkovinám: 1,25 - 1,8 0,30 - 0,55 0,3 - 0,7 0,05 - 0,1
molekulová velikost (Ko)
agarosa sítóvaná pro chromatografií R 95 % < 0,75 60 % < 0,2 50 % 0,3 - 0,6 85 % < 0,3
 agarosa sítóvaná pro chromatografii RI 0,6 - 0,7 85 % < 0,5    

 

Konečná várka vakcíny

K várce konjugátu se před ředěním na konečnou koncentraci vhodným rozpouštědlem může přidat adjuvans, protimikrobní konzervační látka a stabilizátor.

Pouze konečná várka, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu šarže.

Protimikrobní konzervační látka. Je-li to vhodné, stanoví se množství protimikrobní konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsah je v rozmezí 85 % až 115 % zamýšleného množství.

Sterilita (2.6.1). Vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou půdu použije 10 ml.

Šarže

Pouze šarže, která vyhovuje každému z dále uvedených požadavků na Totožnost, Zkoušky na čistotu a Stanovení účinnosti může být uvolněna pro použití.

Pokud byla zkouška na protimikrobní konzervační látky provedena u konečné várky vakcíny, může se tato zkouška v šarži vynechat.

Hodnota pH (2.2.3). pH vakcíny, je-li třeba rekonstituované, je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Volný PRP. Nenavázaný PRP se stanoví po odstranění z konjugátu, např. iontovou vylučovací chromatografií nebo hydrofobní chromatografií, ultrafiltrací nebo jinou validovanou metodou. Množství volného PRP není větší než množství schválené pro jednotlivý přípravek.

Zkouška totožnosti

Totožnost vakcíny se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) pro PRP.

    Zkoušky na čistotu

    Obsah PRP. Nejméně 80 % deklarovaného množství PRP. Stanoví se bud' jako obsah ribosy (2.5.31), nebo fosforu (2.5.18), vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) nebo iontovou vylučovací kapalinovou chromatografií s pulzní ampérometrickou detekcí (2.2.29).

    Hliník. Je-li jako sorbent použit hydroxid hlinitý, vakcína vyhovuje ve zkoušce předepsané v článku Vaccina ad usum humanum.

    Protimikrobní konzervační látky. Kde je to vhodné, stanoví se množství protimikrobni konzervační látky vhodnou chemickou nebo fyzikálně-chemickou metodou. Obsahuje nejnižší prokazatelně účinné množství a nejvýše 115 % množství uvedeného v označení na obalu.

    Voda (2.5.12). U lyofilizovaných vakcín je obsah vody nejvýše 3,0 %. Sterilita (2.6.1).Vyhovuje zkoušce na sterilitu.

    Pyrogenní látky (2.6.8).Vyhovuje zkoušce na pyrogenní látky. Na 1 kg hmotnosti králíka se vstříkne nitrožilně následující množství: 1 pg PRP v případě vakcíny s difterickým toxoidem nebo CRM 197 difterické bílkoviny jako nosičem; 0,1 pg PRP v případě vakcíny s tetanickým toxoidem jako nosičem; 0,025 pg PRP v případě vakcíny s OMP jako nosičem.

      Uchovávání

      Viz článek Vaccina ad usum humanum.

      Označování

      Viz článek Vaccina ad usum humanum.

      V označení na obalu se uvede:


      1) Pharmeuropa 12,3, 422 (2000). Závazné od 1. 9. 2000.