Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum

Humánní vakcína proti vzteklině připravená v buněčných kulturách

Je to lyofilizovaný přípravek vhodného stabilního lanene viru vztekliny pomnoženého v buněčných kulturách a inaktivovaného validovanou metodou.

Vakcína se rozpustí bezprostředně před použitím podle návodu, vznikne čirá tekutina, která může být zbarvena vzhledem k přítomnosti indikátoru pH.

Vakcína vyhovuje požadavkům článku Vaccina ad usum humanum.

Výroba

Výroba vakcíny je založena na systému jednotné inokulace viru, a je-li virus pomnožován v buněčné linii, používá se systém buněčné banky. Výrobní metoda prokazatelně poskytuje stejnorodou vakcínu, která vyhovuje požadavkům na imunogenitu, neškodnost a stabilitu. Jestliže není stanoveno oprávněnou autoritou jinak, virus v konečné vakcíně neprojde více pasážemi od matečného inokula než virus vakcíny, která vyhověla v ldinické zkoušce na neškodnost a účinnost: dokonce podle autorizované výjimky počet pasáží pro klinickou studii nepřesáhne pět.

Výrobní metoda se validuje, aby se dokázalo, že přípravek, bude-li zkoušen, vyhoví zkoušce na neškodnost pro imunní séra a vakcíny pro humánní použití (2.6.9).

Substrát pro pomnožení viru

Virus se pomnoží v buňkách lidské diploiďní linie (5.2.3), v kontinuální linii schválené oprávněnou autoritou nebo v buňkách kuřecích embryí odvozených z chovu prostého specifikovaných patogenů (5.2.2).

Použitý l~nen viru je identifikován záznamy, včetně informace o původu kmene a následné manipulaci s ním.

Pracovní inokulum se připraví nejvýše pěti pasážemi od matečného inokula. Jen takové pracovní inokulum, které vyhovuje následujícím zkouškám, se může použít pro pomnožování viru.

Totožnost. Každé pracovní inokulum se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Aby se zajistila stejnorodost výroby, stanoví se virová koncentrace v každém pracovním inokulu metodou buněčné kultury za použití imunofluorescence.

Cizí agens (2. 6.16). Pracovní inokulum vyhovuje požadavkům na virová inokula. Je-li virus pasážován na myších mozcích, provedou se specifické zkoušky na myší viry.

Pomnožování a sklizeň viru

Všechny činnosti s buněčnou bankou a následnými buněčnými kulturami probíhají za aseptických podmínek v prostoru, kde se nepracuje s jinými buňkami. Do médií se může použít schválené sérum živočišného, nikoli humánního původu, ale konečné udržovací médium pro buněčný růst při pomnožování viru neobsahuje živočišné sérum: média mohou obsahovat lidský albumin vyhovující článku Albumini humani solutio. Sérum a trypsin použité pro přípravu buněčné suspenze a médií prokazatelně neobsahují infekční cizí agens: trypsin vyhovuje článku Médiapro buněčnou kulturu mohou obsahovat indikátorpH, jako je fenolová červeň, a schválená antibiotika v nejnižší účinné koncentraci. Nejméně 500 ml buněčných kultur použitých pro výrobu vakcíny se ponechá neinfikovaných (kontrolní buňky). Virová suspenze se sklízí jednou nebo vícekrát během inkubace. Více sklizní z téže produkční buněčné kultury se může spojit a považovat za jednu sklizeň. Jen taková jednotlivá sklizeň, která vyhovuje následujícím požadavkům, se může použít pro přípravu inaktivované virové sklizně.

Totožnost. Jednotlivá sklizeň obsahuje virus, který se specifickými protilátkami prokáže jako rabický virus.

Virová koncentrace. Infekční virus se stanoví na buněčných kulturách: turem se sleduje stejnoměrnost výroby.

Kontrolní buňky. Kontrolní buňky z produkční buněčné kultury, z níž se odvozují jednotlivé sklizně, vyhovují zkoušce totožnosti a požadavkům na cizí agens (2.6.16).

Purifikace a inaktivace

Virová sklizeň se může koncentrovat a případně též purifilcovat vhodnými metodami: virová sklizeň se inaktivuje validovanou metodou v pevně definovaném stadiu výroby, které může být před, během nebo po koncentraci nebo purifilcaci. Metoda je prokazatelně schopna inaktivovat rabický virus bez zničení imunogenní aktivity. Při použití betapropiolaktonu nepřesahuje jeho koncentrace v žádné chvíli 1 : 3500.

Pro přípravu konečné várky vakcíny se použije jen taková inaktivovaná virová suspenze, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Inaktivace. Provede se pomnožovací zkouška na zbytkový infekční rabický virus buďto ihned p o inaktivaci, nebo se použije vzorek zmražený bezprostřeďně po inaktivaci a uchovávaný při -70 C. Naočkuje se takové množství inaktivované virové suspenze, které odpovídá nejméně dvaceti pěti dávkám vakcíny na buněčnou kulturu téhož typu, j aký byl použit pro výrobu vakcíny. Po 7 dnech se udělá pasáž. Kultury se ponechají ještě dalších 14 dní a potom se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Zbytková DNK hostitelských buněk. Jestliže se pro pomnožování viru použije kontinuální buněčná linie, stanoví se obsah zbytkové DNK hostitelských buněk vhodnou metodou, jalo je uvedeno v článku Producta ab ADN recombinante, a není větší než 100 pg v j edné lidské dávce.

Konečná várka vakcíny

Konečná várka vakcíny se připraví z jedné nebo více inaktivovaných virových suspenzí. Může se přidat schválený stabilizátor k uchování účinnosti přípravku při lyofilizaci a po ní.

K přípravě šarže se může použít jen taková konečná várka vakcíny, která vyhovuje následujícím požadavkům.

Obsah glykoproteinu. Vhodnou imunochemickou metodou (2. 7.1) se stanoví obsah glylcoproteinu, např. jednoduchou radiální imunodifuzí, metodou ELISA nebo Zkouškou vazby protilátek. Obsah je v rozmezí schváleném pro jednotlivý přípravek.

Sterilita (2.6.1). Konečná várka vakcíny vyhovuje zkoušce na sterilitu, při níž se na každou živnou půdu použije 10 ml.

Šarže

Konečná várka vakcíny se asepticky rozplní do sterilních obalů a lyofilizuje až do obsahu vlhkostí, který zaručuje optimální stabilitu přípravku. Obaly se uzavírají tak, aby se vyloučila kontaminace a pronikání vlhkostí.

K použití se může uvolnit jen taková šarže, která vyhovuje požadavkům uvedeným dále v odstavcích Zkouška totožnosti, Zkouška na čistotu a Stanovení účinnosti. Za předpokladu, že zkouška na inaktivaci byla provedena v inaktivované virové suspenzi s vyhovujícím výsleďkem a zkouška na bovinní sérumalbumin v konečné várce s vyhovujícím výsleďkem, mohou být tyto zkoušky vynechány u šarže.

Zkouška totožnosti

Přítomnost antigenu rabického viru se prokáže vhodnou imunochemickou metodou (2.7.1) za použití protilátek, nejlépe mnonoklonálních. Vedle toho také stanovení účinnosti slouží jako Zkouška totožnosti.

Zkoušky na čistotu

Inaktivace. Množství odpovídající nejméně dvaceti pěti lidským dávkám vakcíny se naočkuje na buněčnou kulturu téhož typu, který byl použit pro přípravu vakcíny. Po 7 dnech se udělá pasáž. Kultury se ponechají ještě dalších 14 dní a potom se zkoušejí na přítomnost rabického viru imunofluorescenční zkouškou. Rabický virus se nezjistí.

Bovinní sérumalbumin. Nejvýše 50 ng v jedné lidské dávce. Obsah se stanoví vhodnou imunochemickou metodou (2. 7.1).

Bakteriální endotoxiny (2.6.14). Nejvýše 25 m.j. v jedné lidské dávce.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). Nejvýše 3,0 %.

Stanovení účinnosti.

Účinnost se stanoví porovnáním dávky potřebné k ochraně myší proti účinku letální dávky rabického viru intracerebrálně podané s množstvím referenčního přípravku nezbytným k vytvoření stejné ochrany. Pro toto porovnání je zapotřebí referenční vakcína kalibrovaná v mezinárodních jednotkách a vhodný rabický virus používaný jako čelenžní přípravek.

Mezinárodní jednotka je účinnost obsažená v deklarovaném množství mezinárodního standardu. Hodnotu účinnosti mezinárodního standardu v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Dále uvedená zkouška používá rovnoběžný model s nejméně třemi body pro zkoušený přípravek i pro referenční přípravek. Pouze pracovník se zkušenostmi s touto metodou podání je oprávněn provádět zjednodušenou zkoušku s jedním ředěním zkoušeného přípravku. Taková zkouška dovoluje pracovníkovi určit, že vakcína má účinnost signifikantně vyšší, než je požadované minimum, ale nedává plnou informaci o validně každého jednotlivého stanovení účinnosti. Užití jednoho ředění dovoluje značnou redukci počtu zvířat předepsaných pro Zkoušku a je zvažováno každou laboratoří ve vztahu k ustanovením Evropské konvence pro ochranu obratlovců používaných pro vědecké a jiné experimentální účely.

Výběr a rozložení zkušebních zvířat. Používají se zdravé samičky myší staré asi 4 týdny hmotnosti 11 g až 15 g a pocházející z jednoho chovu. Myši se rozdělí do šesti skupin o tolika zvířatech, aby byly splněny požadavky na validitu zkoušky. Pro titraci čelenžní suspenze se rozdělí do čtyř skupin po pěti.

Příprava čelenžní suspenze. Myším se intracerebrálně vstříkne kmen CVS rabického viru, a když myši vykazují známky onemocnění, ale před jejich úhynem, se usmrtí, vyjmou se mozky a připraví se homogenát mozkové tkáně ve vhodném ředidle. Větší částice se oddělí odstředěním a supernatant se použije jako čelenžní suspenze. Suspenze se rozplní v malých objemech do ampulí, které se zataví a uchovávají při teplotě nižší než -60 C. Jedna ampule se suspenzí se rozmrazí, vhodným ředidlem se připraví sériová ředění. Každé ředění se intracerebrálně vstříkne skupině pěti myší po 0,03 ml příslušného ředění. Myši se pozorují po dobu 14 dnů. Hodnota LD so neředěné suspenze se vypočítá z počtu zvířat v každé skupině, která vykazují známky onemocnění nebo uhynula mezi pátým a čtrnáctým dnem.

Stanovení účinnosti zkoušené vakcíny. Připraví se tři pětinásobná sériová ředění zkoušeného přípravku a tři pětinásobná sériová ředění referenčního přípravku. Připraví se ředění tak, že u nejlconcentrovanějšího ředění lze očekávat, že ochrání více než 50 % zvířat, jimž bylo podáno, a u nejméně koncentrovaných ředění lze očekávat ochranu nižší než 50 % u zvířat, kterým bylo toto ředění podáno. Každé ze šesti ředění se podá jedné ze šesti šestnáctičlenných skupin zvířat a každé myši se intraperitoneálně vstříkne 0,5 ml toho ředění, které bylo přiděleno skupině. Po sedmi dnech se připraví tři identická ředění zkoušeného přípravku a referenčního přípravku a injekce se opakuje. Sedm dní po druhé injekci se připraví na záldadě předchozí titrace taková suspenze čelenžního viru, aby 0,03 ml obsahovalo 50 LD sa Intracerebrálně se každé vakcinované myši vstříkne 0,03 ml této suspenze. Připraví se tři vhodná sériová ředění čelenžní suspenze a suspenze a ředění se přičlení ke čtyřem skupinám po deseti zvířatech. Čelenžní suspenze a tři ředění se intracerebrálně vstříknou čtyřem skupinám myší po 0,03 ml. Zvířata všech skupin se pozorují 14 dní a zaznamenávají se počty zvířat vykazujících známky onemocnění vzteklinou nebo uhynulých v období od pátého do čtrnáctého dne po čelenži.

Zkoušku lze hodnotit, j estliže 50% ochranná dávka referenčního přípravku i zkoušeného přípravku leží mezi nejvyšší a nejnižší dávkou podanou myši; jestliže titrace čelenžní suspenze prokáže, že 0,03 ml čelenžní suspenze obsahuje nejméně 10 LD só jestliže statistická analýza vykazuje signifikantní sklon a nesignifikantní odchylku linearity nebo rovnoběžnosti v závislosti dávka - odpověd'; jestliže interval spolehlivosti ( = 0,95) je v rozmezí 25 % až 400 % stanovené účinnosti. Vakcína vyhovuje, jestliže stanovená účinnost je nejméně 2,5 m.j. v lidské dávce.

Uchovávání

Viz článek Vaccina ad usum humanun.

Označování

Viz článek Vaccina ad usum humanum.

V označení na obalu se uvede biologický původ buněk použitých k přípravě vakcíny.