Jecoris aselli oleum (typus A)

1999

Rybí olej (typ A)

Je to čištěný olej získaný z čerstvých jater druhu Gadus morhua L. a z jiných druhů čeledi Gadidae, pevné látky jsou odstraněny ochlazením a filtrací. Obsahuje 600 mJ. (180 l.tg) až 2500 mJ. (750 μg) vitaminu A a 60 m.j. (1,5 μg) až 250 m.j. (6,25 μg) vitaminu D3 v gramu.

Oprávněná autorita může povolit přísadu přípustných antioxidantů v předepsaném množství.

Vlastnosti

Čirá nažloutlá viskózní tekutina. Je prakticky nerozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96°Io, mísitelný s etherem petrolejovým.

Zkoušky totožnosti

Základní sestava zkoušek: A, B a C.

Alternativní sestava zkoušek: C a D, viz Obecné zásady (1.2.).

1. Zkouška Vitamin A, metoda A, viz Stanovení obsahu, je zároveň zkouškou totožnosti. Zkoušený roztok (2.2.25) vykazuje maximum při (325 ± 2) nm.

   Zkouška Vitamin A, metoda B, viz Stanovení obsahu, je zároveň zkouškou totožnosti. Na chromatogramu zkoušeného roztoku je pík odpovídající píku all-trans-retinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku.

2. Zkouška Vitamin D3, viz Stanovení obsahu, je zároveň zkouškou totožnosti. Na chromatogramu zkoušeného roztoku (a) je pík odpovídající píku cholekalciferolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b).
3. Zkouška Podíl mastných kyselin, viz Zkoušky na čistotu, je zároveň zkouškou totožnosti.
4. K 0,1 g se přidá 0,5 ml chloroformu R a 1 ml chloridu antimonitého RS a protřepe se; do asi 10 s vznikne tmavě modré zbarvení.

Zkoušky na čistotu

Barva. Zkoušená látka není zbarvena intenzívněji (2.2.2, Metoda 77) než porovnávací roztok připravený takto: ke 3,0 ml základního červeného roztoku se přidá 25,0 ml základního žlutého roztoku a zředí se roztokem kyseliny chlorovodíkové R (10 g/l) na 50,0 ml.

Relativní hustota (2.2.5). 0,917 až 0,930. Index lomu (2.2.6). 1,477 až 1,484.

Číslo anisidinové. Nejvýše 30,0.

Anisidinové číslo je definováno jako stonásobek absorbance roztoku obsahujícího 1 g zkoušené látky ve 100 ml směsi rozpouštědel a zkoumadel při tloušťce vrstvy 10 mm, viz níže uvedený postup. Zkouška se provádí co nejrychleji, za ochrany před aktinickým světlem.

Zkoušený roztok (a). 0,500 g se rozpustí v trimethylpentanu R a zředí se jím na 25,0 ml.

Zkoušený roztok (b). 5,0 ml zkoušeného roztoku (a) se smíchá s 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové R; roztok se protřepe a nechá se stát chráněn před světlem. Porovnávací roztok. 5,0 ml trimethylpentanu R se smíchá s 1,0 ml roztoku p-anisidinu R (2,5 g/l) v kyselině octové ledové R; roztok se protřepe a nechá se stát chráněn před světlem.

Měří se Absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku (a) při 350 nm za použití trimethylpentanu R jako kontrolní tekutiny. Přesně 10 min po přípravě se měří Absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku (b) při 350 nm za použití porovnávacího roztoku jako kontrolní tekutiny.

Anisidinové číslo se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

A_s - absorbanci zkoušeného roztoku (b) při 350 nm,
A_b - absorbanci zkoušeného roztoku (a) při 350 nm,
m - hmotnost zkoušené látky ve zkoušeném roztoku (a) v gramech.

Číslo jodové (2.5.4). 150 až 180.

Číslo peroxidové (2.5.5). Nejvýše 10,0.

Nezmýdelnitelné látky (2.5.7). Nejvýše 1,5 %; stanoví se s 5,0 g zkoušené látky. Stearin. 10 ml se nechá stát 3 h ve vodě s ledem; olej zůstane čirý.

Podíl mastných kyselin

Provede se plynová chromatografie (2.2.28).

Zkoušený roztok. Asi 0,45 g se převede do 10ml odměrné baňky, rozpustí se v hexanu R, který obsahuje 50 mg butylhydroxytoluenu R v 1 litru a zředí se stejným rozpouštědlem na 10,0 ml. 2,0 ml tohoto roztoku se převedou do křemenné zkumavky a rozpouštědlo se opatrně odpaří v proudu dusíku R. Přidá se 1,5 ml roztoku hydroxidu sodného R (20 gn) v methanolu R, převrství se dusíkem R, zkumavka se těsně uzavře zátkou s polytetrafluoroethylenovým těsněním, obsah zkumavky se promíchá a zahřívá se 7 min ve vodní lázni. Po ochlazení se smíchá se 2 ml roztoku chloridu boritého v methanolu RS, roztok se převrstvi dusíkem R, zkumavka se těsně uzavře, promíchá se a zahřívá se 30 min ve vodní lázni. Pak se ochladí na 40 °C až 50 °C, přidá se 1 ml trimethylpentanu R, zkumavka se uzavře a obsah se intenzívně protřepává nejméně 30 s. Pak se okamžitě přidá 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného R, roztok se převrstvi dusa7cem R, zkumavka se uzavře a protřepává se důkladně nejméně 15 s. Po oddělení vrstev se horní čirá vrstva převede do jiné zkumavky. Methanolová vrstva se protřepe ještě jednou 1 ml trimethylpentanu R a trimethylpentanové extrakty se spojí. Spojené extrakty se protřepou dvakrát 1 ml vody R a pak se vysuší síranem sodným bezvodým R. Připraví se vždy dva roztoky.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• křemenné kapilární kolony délky nejméně 30 m a vnitřního průměru 0,25 mm se stěnou pokrytou makrogolem 20 000 R (tloušťka vrstvy 0,25 μm),
• vodíku pro chromatografii R nebo helia pro chromatografii R jako nosného plynu za použití zařízení pro odstranění kyslíku,
• plamenoionizačního detektoru,  
• injektoru s děličem 1 : 200,
• vhodného integrátoru.

Teplota kolony je 170 °C, pak se zvyšuje rychlostí 1 °C/min až na 225 °C, při níž se udržuje 20 min; teplota vstřikovacího prostoru je 250 °C a teplota detektoru je 280 °C.

Nastříkne se dvakrát 1 µl zkoušeného roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• patnáct nalezených mastných kyselin se shoduje s mastnými kyselinami na vzorovém chromatogramu, viz obrázek č. 1,
• po nástřiku směsi stejných množství methylpalmitatu R, methylstearatu R, methylarachidatu R a methylbehenatu R jsou plochy píků těchto látek v procentech: 24,4, 24,8, 25,2 a 25,6,
• rozlišení mezi píky methyloleatu a methyl-cis-vakcenatu je nejméně 1,3 a dvojice píků odpovídajících methylgadoleatu a methylgondoatu je dostatečně rozdělená, aby bylo možné výše uvedené látky identi%kovat a změřit plochy píků.

Plocha píku v procentech pro každý methylester mastné kyseliny se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

A_x - plochu píku mastné kyseliny x,
A_t - součet ploch všech píků.

Výpočet lze hodnotit, jestliže:

• součet ploch všech píků zahrnuje pouze píky jednotlivých methylesterů mastných kyselin,
• počet píků methylesterů mastných kyselin, jejichž plocha je větší než 0, 05 % součtu ploch, činí nejméně dvacet čtyři,
• dvacet čtyři největších píků methylesterů mastných kyselin tvoří více než 90 % součtu ploch, (v elučním pořadí: 14 : 0,15 : 0,16 : 0,16 : 1 n-7,16 : 4 n-1,18 : 0,18 : 1 n-9,18 : 1 n-7,18 : 2 n-6,18 : 3 n-3,18 : 4 n-3,20 : 1 n-11,20 : 1 n-9,20 : 1 n-7,20 : 2 n-6,20 : 4 n-6,20 : 3 n-3,20 : 4 n-3,20 : 5 n-3,22 : 1 n-11,22 : 1 n-9,21 : 5 n-3,22 : 5 n-3 a 22 : 6 n-3).

Následující vzor chromatogramu je pouze pro informaci a tato část není součástí požadavků článku.

Obr. 1. Vzorový chromatogram pro zkoušku Podíl mastných kyselin

Stanovení obsahu

Zkouška se provede co nejrychleji, za ochrarry před aktinickým světlem a vzduchem, oxidačními činidly, oxidačními katalyzátory (např. mědí a železem) a kyselinami.

Vitamin A. Provede se absorpční spektrofotometrie v ultrafialové oblasti (2.2.25) (Metoda A). Jestliže výsledky Metody A nelze hodnotit, provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) (Metoda B).

Metoda A

Zkoušený roztok. 1,00 g se v baňce s kulatým dnem smíchá se 3 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R 50°Io a 30 ml ethanolu R. Vaří se 30 min pod zpětným chladičem v proudu dusíku R. Pak se rychle ochladí, přidá se 30 ml vody R a protřepe se čtyřikrát 50 ml etheru R, po posledním protřepání se dokonale oddělená spodní vrstva odstraní. Spojené horní vrstvy se protřepou čtyřikrát 50 ml vody R a odpaří se opatrně proudem dusíku R do sucha při teplotě nepřevyšující 30 °C nebo v rotační vakuové odparce za sníženého tlaku při teplotě nepřevyšující 30 °C. Zbytek se rozpustí v dostatečném množství 2-propanolu Rl , tak aby koncentrace vitaminu A byla 10 m.j. až 15 m.j. v 1 mililitru roztoku.

Měří se absorbance roztoku při 300 nm, 310 nm, 325 nm a 334 nm a při vlnové délce maximální absorpce vhodným spektrofotometrem ve zvlášť upravených kyvetách při tloušťce vrstvy 10 mm za použití 2-propanolu RI jako kontrolní tekutiny.

Obsah vitaminu A, počítáno jako all-trans-retinol, v mezinárodních jednotkách v 1 gramu zkoušené látky se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

A₃₂₅ - absorbanci při 325 nm,
m - navážku zkoušené látky v gramech,
V - celkový objem roztoku obsahujícího 10 m.j. až 15 mJ. vitaminu A v 1 mililitru,
1830 - přepočítávací faktor pro specifickou absorbanci all-trans-retinolu v mezinárodních jednotkách.

Uvedený vzorec lze použít pouze v případě, že hodnota A325 není větší než hodnota A325,corr/0,970, kde A325,corr je upravená absorbance při 325 nm daná vztahem:

A_325,corr= 6,815 A₃₂₅ - 2,555 A₃₂₅ - 4,260 A₃₃₄,

Dolní index písmene A značí odpovídající vlnovou délku.

Je-li hodnota A325 větší než hodnota A_325,corr/0,970, vypočítá se obsah vitaminu A ze vztahu:

Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• absorpčního maxima je dosaženo při 323 nm až 327 nm,
• poměr absorbance při 300 nm k absorbanci při 325 nm je nejvýše 0, 73.

Metoda B

Zkoušený roztok. 2,00 g se v baňce s kulatým dnem smíchají s 5 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R (100 g/l), 10 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (800 g/I) a 100 ml ethanolu R. Vaří se 15 min pod zpětným chladičem na vodní lázni, pak se přidá 100 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l) a ochladí se. Roztok se převede do 500ml dělicí nálevky spolu s asi 75 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l) a pak 150 ml směsi stejných objemových dílů etheru petrolejového R3 a etheru R, kterými byla promyta baňka. Protřepává se 1 min. Po dokonalém oddělení se postupně odstraní spodní vrstva a horní vrstva se protřepe nejprve 50 ml roztoku hydroxidu draselného R (30 gn) v roztoku ethanolu R 10% (VN) a pak třikrát 50 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l). Horní vrstva se zfiltruje přes 5 g síranu sodného bezvodého R do 250ml baňky vhodné pro odpařování za sníženého tlaku (rotační vakuová odparka). Nálevka se promyje 10 ml čerstvě připravené extrakční směsi. Promývací tekutina a horní vrstvy se spojí a odpaří se za sníženého tlaku při teplotě nepřevyšující 30 °C, zbytek po odpaření se převrství dusíkem R. Rozpouštědla se mohou odpařit i v proudu dusíku R při teplotě nepřevyšující 30 °C. Zbytek se rozpustí v 2-propanolu R, převede se do odměrné baňky a zředí se 2-propanolem R na 25 ml, je-li- třeba opatrně se zahřeje v ultrazvukové lázni (velký podfl bílého zbytku tvoří cholesterol, který představuje přibližně 50 % nezmýdelnitelných látek rybího oleje). Porovnávací roztok (a). Připraví se roztok retinylacetatu CRL v 2-propanolu Rl tak, aby 1 ml obsahoval asi 1000 m.j. all-trans-retinolu.

Přesná koncentrace porovnávacího roztoku (a) se určí absorpční spektrofotometrií v ultrafialové oblasti (2.2.25). Porovnávací roztok (a) se zředí 2-propanolem RI tak, aby koncentrace vitaminu A byla 10 mJ. až 15 mJ. v mililitru a změří se absorbance při 326 nm ve zvlášť upravených kyvetách při tloušťce vrstvy 10 mm za použití 2-propanolu Rl jako kontrolní tekutiny.

Obsah vitaminu A v porovnávacím roztoku (a) v mezinárodních jednotkách v mililitru se vypočítá s přihlédnutím k udanému obsahu retinylacetatu CRL ze vztahu:

v němž značí:

A₃₂₆ - absorbanci při 326 nm,
V₂ - objem zředěného roztoku,
V₁ - použitý objem porovnávacího roztoku (a),
1900 - přepočítávací faktor pro specifickou absorbanci retinylacetatu CRL v mezinárodních jednotkách.

Porovnávací roztok (b).Připraví se způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený roztok. Místo zkoušené látky se použijí 2,00 ml porovnávacího roztoku (a).

Přesná koncentrace porovnávacího roztoku (b) se určí absorpční spektrofotometrií v ultraňalové oblasti (2.2.25). Porovnávací roztok (b) se zředí 2-propanolem RI tak, aby koncentrace all-trans-retinolu v roztoku byla 10 mJ. až 15 mJ. v mililitru a změří se absorbance při 325 nm ve zvlášť upravených kyvetách při tloušťce vrstvy 10 mm za použití 2-propanolu RI jako kontrolní tekutiny.

Obsah all-trans-retinolu v porovnávacím roztoku (b) v mezinárodních jednotkách v mililitru se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

A₃₂₅ - absorbanci při 325 nm,
V₃ - objem zředěného roztoku,
V₄ - použitý objem porovnávacího roztoku (b),
1830 - přepočítávací faktor pro specifickou absorbanci all-trans-retinolu v mezinárodních jednotkách.

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 μm až 10 μm),
• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů vody R a methanolu R -;(3 + 97), při průtokové rychlosti 1 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 325 nm,  
• injektorové smyčky (10 µl),
• elektronického integrátoru.

Nastříkne se třikrát zkoušený roztok a porovnávací roztok (b). Retenční čas all-trans-retinolu je (5 ± 1) min.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• na chromatogramu zkoušeného roztoku je pík odpovídající all-trans-retinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku (b),
• při použití metody standardního přídavku ke zkoušenému roztoku je návratnost retinylacetatu CRL nejméně 95 %,
• návratnost all-trans-retinolu v porovnávacím roztoku (b) určená přímou absorpční spektrofotometrií je větší než 95 %.

Obsah vitaminu A se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

Vitamin D3. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29).

Zkouška se provádí co nejrychleji, za ochrarry před aktinickým světlem a vzduchem.

Roztok vnitřního standardu. 0,50 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí ve 100 tnl ethanolu R. Zkoušený roztok (a). 4,00 g se v baňce s kulatým dnem smíchají s 5 ml čerstvě připraveného roztoku kyseliny askorbové R (100 g/l), 10 ml čerstvě připraveného roztoku hydroxidu draselného R (800 g/l) a 100 ml ethanolu R. Vaří se 30 min pod zpěfiým chladičem na vodní lázni, pak se přidá 100 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l) a ochladí se na pokojovou teplotu. Roztok se převede do 500ml dělicí nálevky spolu s asi 75 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l) a pak 150 ml směsi stejných objemových dílů etheru petrolejového R3 a etheru R, kterými byla promyta baňka, a 1 min se protřepává. Po dokonalém oddělení se spodní vrstva odstraní, horní vrstva se protřepe nejprve 50 ml roztoku hydroxidu draselného R (30 gn) v roztoku ethanolu R 10% (VN) a pak třikrát 50 ml roztoku chloridu sodného R (10 g/l). Horní vrstva se zfiltruje přes 5 g síranu sodného bezvodého R do 250ml baňky vhodné pro odpařování za sníženého tlaku (vakuová odparka). Nálevka se promyje 10 ml čerstvě připravené extrakční směsi, promývací tekutina a horní vrstvy se spojí a odpaří se za sníženého tlaku při teplotě nepřevyšující 30 °C; zbytek po odpaření se převrství dusíkem R. Rozpouštědla se mohou opatrně odpařiti v proudu dusíku R při teplotě nepřevyšující 30 °C. Zbytek se rozpustí v 1,5 ml mobilní fáze, kterou je směs objemových dílů isoamylalko-holu R v hexanu R (1,6 + 98,4), je-li třeba opatrně se zahřeje v ultrazvukové lázni (velký podíl bílého zbytku tvoří cholesterol, který představuje asi 50 % nezmýdelnitelných látek rybího oleje).

Zkoušený roztok (b). 4,00 g se smíchají se 2,0 ml roztoku vnitřního standardu a dále se postupuje způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený roztok (a).

Porovnávací roztok (a). 0,50 mg cholekalciferolu CRL se rozpustí ve 100,0 ml ethanolu R.

Porovnávací roztok (b). V baňce s kulatým dnem se smíchají 2,0 ml porovnávacího roztoku (a) a 2,0 ml roztoku vnitřtrního standardu a dále se postupuje způsobem uvedeným v odstavci Zkoušený roztok (a).

Čištění

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem kyansilanizovaným pro chromatografie R (10 μm),
• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů isoamylalkoholu R a hexanu R (1,6 + 98,4), při průtokové rychlosti 1,1 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 265 nm.

Nastříkne se 350 µl porovnávacího roztoku (b). Eluát se jímá 2 min před a 2 min po retenčním času odpovídajícím cholekalciferolu do zkumavky se zábrusem, která obsahuje 1 ml roztoku butylhydroxytoluenu R (1 g/l) v hexanu R. Postup se opakuje se zkoušeným roztokem (a) a zkoušeným roztokem (b). Eluáty získané z porovnávacího roztoku (b), zkoušeného roztoku (a) a zkoušeného roztoku (b) se odděleně odpaří do sucha v mírném proudu dusc7cu R při teplotě nepřevyšující 30 °C. Každý zbytek se rozpustí odděleně v 1,5 ml acetonitrilu R.

Stanovení

Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

• nerezové ocelové kolony délky 0,15 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (5 µm),
• mobilní fáze, která je směsí objemových dílů kyseliny fosforečné R a roztoku acetonitrilu R 96% (VN) (0,2 + 99,8), při průtokové rychlosti 1 ml/min,
• spektrofotometrického detektoru, 265 nm.

Nastříkne se dvakrát nejvýše 200 µl každého ze tří roztoků uvedených v odstavci Čištění.

Zkoušku lze hodnotit, jestliže:

• na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) je rozlišení mezi píky ergokalciferolu a cholekalciferolu nejméně 1,4,
• při použití metody standardního přídavku ke zkoušenému roztoku (a) je návratnost cholekalciferolu CRL nejméně 95 %, vztaženo na vnitřní standard.

Obsah vitaminu D3 v mezinárodních jednotkách v gramu zkoušené látky, s přihléďnutím k udanému obsahu cholekalciferolu CRL, se vypočítá ze vztahu:

v němž značí:

Uchovávání

Pod inertním plynem ve vzduchotěsných, zcela naplněných obalech, chráněn před světlem.

Po otevření obalu se olej spotřebuje co nejrychleji; nespotřebovaný olej by měl být uchováván pod inertním plynem.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• název a množství přidaného antioxidantu, byl-li přidán, 
• počet mezinárodních jednotek vitaminu A,
• počet mezinárodních jednotek vitaminu D3.