Tetracosactidum

2001

Tetrakosaktid

Ser-Tyr-Ser-Met-GIu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-10

Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-20

Je to syntetický tetrakosapeptid, který má stejné pořadí aminokyselin, jako prvních 24 zbytků aminokyselin v molekule lidského kortikotropinu. Je dostupný jako octan a obsahuje vodu. Zvyšuje vyměšování kortikoidních hormonů nadledvin. Počítáno na bezvodou a kyseliny octové prostou látku, účinnost je nejméně 800 m.j. v miligramu.

Vlastnosti

Bílý nebo žlutý amorfní prášek. Je mírně rozpustný ve vodě.

Zkoušky totožnosti

1. V podmínkách popsaných ve Stanovení obsahu zvyšuje zkoušená látka množství kortikosteronu vytvářeného izolovanými buňkami nadledvin potkanů.
2. Provede se elektroforéza (2.2.31) a tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) k dosažení dvojrozměrného rozdělení. Použijí se dvě desky s vrstvou celulosy pro chromatografii R1.

Zkoušený roztok. 1 mg se rozpustí v 0,2 ml roztoku octanu amonného R (15,4 g/l), jehož pH se upraví amoniakem zředěným RS2 na hodnotu 8,2. Potom se přidá 10 µl roztoku trypsinu R (2 g/l). Směs se 40 min inkubuje při 37 °C až 38 °C a pak se 3 min vaří ve vodní lázni. Nakonec se přidá 5 µl kyseliny octové ledové R a odpaří se do sucha při 40 °C a tlaku, který nepřesáhne 3 kPa. Sklovitý odparek se suší 1 h při 40 °C a pak se rozpustí v 0,1 ml kyseliny octové ledové R. Roztok se lyofilizuje, zbytek se rozpustí v 0,1 ml vody R a znovu se lyofilizuje. Konečný zbytek se 1 h suší při 45 °C a tlaku, který nepřesáhne 3 kPa, a pak se rozpustí v 50 µl vody R.

Porovnávací roztok. Připraví se současně a stejným způsobem jako zkoušený roztok; místo zkoušené látky se však použije tetrakosaktid CRL.

Vrstvy se postříkají roztokem elektrolytu, který obsahuje 0,2 % (V/V) kyseliny octové ledové R a 0,2 % (V/V) pyridinu R. Pomocí filtračních pásků 1,5 cm širokých se spojí konce vrstev s příslušnou komůrkou každého chromatografického žlábku. Celá nádoba se uzavře a nechá 30 min stát. Pak se nanesou roztoky na anodovou stranu. Na první vrstvu se do rohu asi 2,5 cm od každé strany nanesou 4 µl zkoušeného roztoku. Na druhou vrstvu se ve stejném místě nanesou 4 µl porovnávacího roztoku. Obě vrstvy se vyvíjejí 90 min při napětí 280 V na 200 mm délky. Pak se suší 30 min na vzduchu a následovně 30 min v proudu vzduchu při 30 °C. Potom se na každé vrstvě provede druhé dělení chromatograficky. Vyvíjí se v pravém úhlu vzhledem ke směru elektroforézy směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (8 + 24 + 30 + 38) po dráze 15 cm. Vrstvy se usuší v proudu vzduchu a postříkají ninhydrinem RS1. Hlavní skvrny na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídají svou polohou skvrnám na chromatogramu porovnávacího roztoku, ale jejich intenzita se může lišit.

Zkoušky na čistotu

Specifická optická otáčivost (2.2.7). -99° až -109°, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Měří se roztok připravený rozpuštěním 10,0 mg v 1,0 ml směsi objemových dílů kyseliny octové ledové R a vody R (1 + 99).

Absorbance (2.2.25). 1,0 mg se rozpustí v kyselině chlorovodíkové 0,1 mol/l RS a zředí se jí na 5,0 ml. Měří se absorbance tohoto roztoku při 240 nm až 280 nm. Absorpční maximum je při 276 nm. Absorbance v maximu je 0,51 až 0,61, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové. Poměr absorbance naměřené v maximu při 276 nm k absorbanci při 248 mn je 2,4 až 2,9.

Aminokyseliny. Stanoví se pomocí aminokyselinového analyzátoru. Přístroj se kalibruje směsí obsahující ekvimolární množství amoniaku, glycinu a L-forem následujících aminokyselin:

spolu s polovinou ekvimolárního množství L-cystinu. Pro validaci metody se použije vhodný vnitřní standard, např. norleucin R.

Zkoušený roztok. 1,0 mg se převede do pečlivě vyčistěné zkumavky z tvrzeného skla délky 100 mm a vnitřního průměru 6 mm. Přidá se vhodné množství roztoku kyseliny chlorovodíkové R 50% (V/V). Zkumavka se ponoří do mrazicí směsi - 5 °C, sníží se tlak pod 133 Pa a dokonale se uzavře. Pak se zahřívá 16 h při 110 °C až 115 °C. Po ochlazení se zkumavka otevře a obsah se převede do 10 ml baňky pomocí pětkrát 0,2 ml vody R a za sníženého tlaku se odpaří do sucha nad hydroxidem draselným R. Zbytek se převede do vody R a odpaří se za sníženého tlaku do sucha nad hydroxidem draselným R. Tento postup se opakuje ještě jednou. Zbytek se převede do vhodného tlumivého roztoku pro analyzátor aminokyselin a zředí se stejným tlumivým roztokem na vhodný objem. K analýze aminoanalyzátoru se použije vhodný objem.

Obsah každé aminokyseliny se vyjádří v molech. Relativní poměr aminokyselin se vypočítá s předpokladem, že podíl valinu odpovídá 3. Hodnoty se pak pohybují v následujících rozmezích: lysin 3,5 až 4,7, histidin 0,9 až 1,1, arginin 2,7 až 3,3, serin 1,1 až 2,2, kyselina glutamová 0,9 až 1,1, prolin 2,5 až 3,5, glycin 1,8 až 2,2, methionin 0,9 až 1,1, tyrosin 1,7 až 2,2, fenylalanin 0,9 až 1,1. V hydrolyzátu mohou být dále přítomny pouze stopy ostatních aminokyselin, kromě tryptofanu.

Příbuzné peptidy.

1. Provede se kapalinová chromatografie (2.2.29) za použití odplyněných rozpouštědel.

   Zkoušený roztok. 1,0 mg se rozpustí v 1 ml vody R.

   Porovnávací roztok (a). 1,0 mg zkoušené látky se rozpustí v 1 ml roztoku kyseliny octové ledové R 1% (V/V), přidá se 50 µl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999). Nechá se 2 h stát.

   Porovnávací roztok (b). 1 , 0 mg tetrakosaktidu CRL se rozpustí v 1 ml vody R.

   Chromatografický postup se obvykle provádí za použití:

   • nerezové ocelové kolony délky 0,25 m a vnitřního průměru 4,6 mm naplněné silikagelem oktadecylsilanizovaným pro chromatografii R (10 µm),
   • mobilní fáze, která je směsí 365 ml acetonitrilu R, 10,0 ml kyseliny octové ledové R a 10,0 g síranu amonného R, zředěné vodou R na 2000 ml. Průtoková rychlost je 2,0 ml/min,
   • spektrofotometrického detektoru, 280 nm.

   Nastříkne se po 20 µl každého roztoku a zajistí se, aby stříkačka, kterou se nastřikuje zkoušený roztok, nebyla kontaminována peroxidem. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je pík tetrakosaktidu odpovídající hlavnímu píku na chromatogramu zkoušeného roztoku a pík s menším retenčním časem odpovídající sulfoxidu tetrakosaktidu. Jeho plocha je významně větší než plocha příslušného píku na chromatogramu zkoušeného roztoku. Zkoušku lze hodnotit, jestliže na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) je rozlišení mezi píky odpovídajícími tetrakosaktidu a sulfoxidu tetrakosaktidu nejméně 7. Na chromatogramu zkoušeného roztoku plocha píku odpovídajícího sulfoxidu tetrakosaktidu není větší než 4 % součtu ploch všech píků. Nepřihlíží se k píkům rozpouštědla a mobilní fáze.

2. Provede se tenkovrstvá chromatografie (2.2.27) za použití vrstvy celulosy pro chromatografi R.

   Zkoušený roztok. 3,0 mg se rozpustí v 1,5 ml směsi stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R.

   Porovnávací roztok (a). 0,5 ml zkoušeného roztoku se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (b).5 ml porovnávacího roztoku (a) se zředí směsí stejných objemových dílů kyseliny octové zředěné RS a vody R na 10 ml.

   Porovnávací roztok (c). K 0,5 ml zkoušeného roztoku se přidá 50 µl směsi objemových dílů peroxidu vodíku koncentrovaného R a vody R (1 + 999) a nechá se 2 h stát.

   Na vrstvu se nanese odděleně po 10 µl každého roztoku do asi 1cm pruhů a vyvíjí se směsí objemových dílů kyseliny octové ledové R, pyridinu R, vody R a 1-butanolu R (4 + 24 + 30 + 42) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší v proudu vzduchu a postříká se ninhydrinem RSI. Na chromatogramu porovnávacího roztoku (c) je skvrna odpovídající polohou hlavní skvrně na chromatogramu zkoušeného roztoku, ale má menší intenzitu a navíc je přítomna výrazná skvrna sulfoxidu tetrakosaktidu s nižším R_F. Na chromatogramu zkoušeného roztoku není, kromě hlavní skvrny a skvrny sulfoxidu tetrakosaktidu, žádná skvrna intenzívnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (a) (5,0 %) a nejvýše jedna taková skvrna může být intenzívnější než skvrna na chromatogramu porovnávacího roztoku (b) (2,5 %).

Peptidy. Nejméně 85,0 % C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S, počítáno na bezvodou látku prostou kyseliny octové.

Vyhodnotí se chromatogramy získané ve zkoušce (A) Příbuzné peptidy. Obsah C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S se vypočítá z výšek píků nebo jejich ploch na chromatogramu zkoušeného roztoku a porovnávacího roztoku (b) a deklarovaného množství C₁₃₆H₂₁₀N₄₀O₃₁S v tetrakosaktidtu CRL.

Kyselina octová (2._5.34). 8,0 % až 13,0 %.

Zkoušený roztok. 10,0 mg se rozpustí ve směsi objemových dílů mobilní fáze B a mobilní fáze A (5 + 95) a zředí se stejnou směsí na 10,0 ml.

Voda, semimikrostanovení (2.5.12). 5,0 % až 16,0 %;stanoví se s 80,0 mg zkoušené látky.

Stanovení účinnosti.

Účinnost zkoušené látky se stanoví za daných podmínek porovnáním její schopnosti zvyšovat množství kortikosteronu produkovaného izolovanými buňkami z nadledvin potkanů s účinností mezinárodního referenčního přípravku tetrakosaktidu nebo porovnávacího přípravku kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.

Mezinárodní jednotka je účinnost, kterou má deklarované množství mezinárodního referenčního přípravku, který se skládá ze syntetického tetrakosaktidu a mannitolu. Hodnotu účinnosti mezinárodního referenčního přípravku v mezinárodních jednotkách vyhlašuje Světová zdravotnická organizace.

Nalezená hodnota účinnosti je v rozmezí 80 % až 125 % deklarované účinnosti. Interval spolehlivosti (P = 0,95) nalezené účinnosti je v rozmezí 64 % až 156 % deklarované účinnosti.

Obr. 1 Míchací zařízení
Rozměry v milimetrech

A - kladka a míchací lopatka,
B - ložisko,
C - inkubační roztok.

Použije se silikonované sklo, před použitím dobře vymyté vodou. Čtyři potkani, samci, každý vážící 200 g až 400 g, se usmrtí vykrvácením. Vyjmou se nadledviny, opatrně se očistí od okolní tukové tkáně a vloží se do roztoku B uchovávaného při 4 °C. Každá žláza se rozřízne na čtyři stejné díly a přenese do vhodného míchacího zařízení z plastické hmoty (viz obrázek 1), ve kterém je 5 ml roztoku C udržovaného při 37 °C. Buňky nadledvin se dispergují mícháním směsi při 500 ot/min. Po 20 min se odstraní supernatantní tekutina, ochladí se na 4 °C, přidá se 5 ml roztoku C a znovu se míchá. Tento postup se opakuje ještě třikrát. Všech pět supernatantních tekutin se spojí a odstřed'uje se 30 min v polyethylenové zkumavce při 4 °C při postupném zvyšování rychlosti na 100 g_n. Získaný sediment se suspenduje v 8 ml roztoku D a 30 min se odstřed'uje při 100 g_n. Získaný sediment se znovu suspenduje v 8 ml roztoku D, směs se filtruje přes nylonovou síťku s otvory 100 µm do polyethylenové kádinky a k filtrátu se přidá vhodný objem roztoku D (bylo zjištěno, že vhodný celkový objem je mezi 65 ml až 105 ml). Výsledná buněčná suspenze se uchovává při 4 °C.

Ze zkoušeného roztoku o vhodné koncentraci a z porovnávacího roztoku se připraví s ředícím roztokem E čtyři koncentrace v geometrické řadě s dvojnásobným ředěním. 0,1 ml z každého zředění se pipetuje do každé ze čtyř polystyrenových zkumavek a do každé zkumavky se přidá 1,0 ml výše připravené buněčné suspenze. Zkumavky se inkubují 2 h při 37 °C a pak se ochladí na 4 °C. 1 ml obsahu každé zkumavky se přenese do skleněných zkumavek obsahujících 1,4 ml dichlormethanu R, směs se promíchá 10 s na vířivé míchačce a odstřed'uje se 5 min při 3000 g_n. 1 ml dichlormethanové vrstvy z každé zkumavky se přenese, bez porušení vodné vrstvy, do skleněných zkumavek obsahujících 0,6 ml směsi objemových dílů lihu 96% R a kyseliny sírové R (15 + 35). Směs se 10 s míchá na vířivé míchačce, odstřed'uje se 5 min při 1500 g_n a nechá se 30 min stát.

Provede se fluorimetrie (2.2.21). Spodní vrstva se vystaví excitačnímu záření vhodné vlnové délky, např. 436 nm nebo 470 nm a měří se intenzita fluorescence v maximu mezi 530 nm a 545 nm. Jestliže roztoky nejsou při měření přeneseny do kyvet, je nutné vybrat zkumavky, v nichž fluorescenční hodnoty pro standard kortikosteronu se neliší mezi sebou více než o 5 %. Výsledek stanovení se počítá obvyklými statistickými metodami za použití lineární části logaritmické křivky odpovědi na dávce.

Výše uvedené látky se rozpustí v asi 950 ml vody R, pH roztoku se upraví hydroxidem sodným 1 mol/l RS na hodnotu 7,4, přidá se 60 mg benzylpenicilinu sodné soli R a takové množství streptomyciniumsulfatu R, které odpovídá 100 mg streptomycinu. Pak se roztok zředí vodou R na 1000 ml.

Roztok B. K roztoku A se přidá glukosa R (2 g/l ).

Roztok C. K roztoku B se přidá kolagenasa získaná z Clostridium histolyticum a dostatečně čistá pro přípravu dispergovaných buněk (1 g/l).

Roztok D. K roztoku B se přidá albumin hovězí R (5 g/l).

Roztok E. Ke sterilnímu roztoku chloridu sodného R (9 g/l) se přidá albumin hovězí R (1 g/l) a pH roztoku se upraví kyselinou chlorovodíkovou 1 mol/l RS na hodnotu 2,0.

Uchovávání

Pod dusíkem, chráněn před světlem, při teplotě 2 °C až 8 °C.
Separandum.

Označování

V označení na obalu se uvede:

• účinnost v mezinárodních jednotkách na miligram,
• obsah peptidu v balení,
• podmínky uchovávání.